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专利号: 202110648729X
申请人: 安徽医科大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种检测筛查新冠病毒N501Y突变的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括:一组RT‑RAA扩增引物:

RT‑RAA上游引物:

5’‑GAAATTAATACGACTCACTATAGGGccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttac‑3’;

RT‑RAA下游引物:5’‑gttcaaaagaaagtactactactctgtatgg‑3’;

一种特异性检测N501Y突变的crRNA序列:M1crRNA:

5’‑gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacaccuuaaguggguuggaaaccauaugau‑3’;

RNA荧光探针:

5’‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA‑BHQ1‑3’;其中m为2位氧甲基修饰,r代表核糖核苷酸。

2.根据权利要求1所述的检测筛查新冠病毒N501Y突变的试剂盒,其特征在于:还包括buffer A溶液和BufferB溶液;buffer A溶液配置方法为:向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液,100nmol的醋酸钾,20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇;BufferB溶液为浓度为

280mM的醋酸镁溶液。

3.根据权利要求1所述的检测筛查新冠病毒N501Y突变的试剂盒,其特征在于:还包括:HEPES缓冲液、MgCl2溶液、10×NEB buffer2.1缓冲液、RNase inhibitor、T7 RNA polymerase、无RNA酶水。

4.一种检测筛查新冠病毒N501Y突变的方法,其特征在于:包括下列步骤:步骤1:将待检测样本浸入病毒保存液中,然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取,得到待检核酸;

步骤2:向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中,加入41.5μL的buffer A溶液,2μL RT‑RAA上游引物,2μL RT‑RAA下游引物以及2μL待检核酸,然后加2.5μL的BufferB溶液,盖上反应管的管盖后进行扩增反应,得到核酸扩增产物;

RT‑RAA上游引物:

5’‑GAAATTAATACGACTCACTATAGGGccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttac‑3’;

RT‑RAA下游引物:5’‑gttcaaaagaaagtactactactctgtatgg‑3’;

步骤3:配置CRISPR反应混合液:将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、0.18μL的浓度为

1M的MgCl2溶液、0.8μL的浓度为10uM的rNTP mix、2μL的浓度为的63.2ng/μL的LwaCas13a、1μL的浓度为40U/μL的RNase inhibitor、0.1μL的浓度为50U/μL的T7 RNA polymerase、0.5μL的浓度为10ng/μL的M1 crRNA、0.2μL的浓度为100uM的RNA荧光探针和12.82μL的无RNA酶水混合;

M1crRNA:

5’‑gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacaccuuaaguggguuggaaaccauaugau‑3’;

RNA荧光探针:

5’‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA‑BHQ1‑3’;其中m为2位氧甲基修饰,r为RNA;

步骤4:取2μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的CRISPR反应混合液,

37℃孵育30分钟;通过下列方法进行判断:

1、通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光,或直接水浴最后肉眼观察荧光变化;

2、在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值,37℃孵育20个循环,每个循环间隔2分钟,每次循环结束记录一次荧光信号,通过最终荧光信号强度判断N501Y检测结果,即荧光值大于3000代表N501Y检测阳性,荧光值小于2000代表N501Y检测阴性,若荧光值处于2000‑3000之间则重新检测一次,若荧光值依然为2000‑3000则判定N501Y检测阳性;若现场无qPCR等荧光读取仪器,亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为

485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果;N501Y检测阳性的反应管会发出黄绿色荧光,N501Y检测阴性反应管则无荧光。

5.根据权利要求4所述的检测筛查新冠病毒N501Y突变的方法,其特征在于:buffer A溶液配置方法为:向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液,100nmol的醋酸钾,20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇;BufferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶液。