1.一种基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器的制备及对前列腺抗原(PSA)和Let‑7a miRNA的检测应用，其特征是：利用电化学发光共振能量转移(ECL‑RET)技术，制备了电化学发光免疫传感器，通过“off‑on”检测模式，实现了对前列腺抗原和Let‑7a miRNA的灵敏分析。首先采用金纳米团簇(Met‑Au NCs)修饰电极，构建了Met‑AuNCs ECL供体与Au‑MnO2纳米花受体之间的高效ECL‑RET系统，制备了一种信号“off”的ECL免疫传感器检测PSA。然后，Let‑7amiRNA(目标二)触发滚环放大(RCA)反应产生长DNA纳米线，该纳米线可以连接大量生物素‑链霉亲和素结构，标记大量碱性磷酸酶(ALP)，ALP催化L‑抗坏血酸‑

2+

2‑磷酸三钠(AAP)原位产生大量抗坏血酸(AA)。AA将MnO2还原为Mn ，抑制了MnO2对Met‑AuNCs ECL的猝灭，并获得明显的ECL信号“ON”状态，用于Let‑7a检测。

2.权利要求1所述的基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器的制备及对前列腺抗原(PSA)和Let‑7a miRNA的检测应用，其特征方法由下列步骤组成：步骤1.蛋氨酸‑金纳米团簇(Met‑Au NCs)的制备：将40mL蛋氨酸和6mL NaOH混合后添加到4mL HAuCl4溶液(20mg/mL)中，并以400rpm进行充分搅拌。上述反应在37℃下持续6小时，得到Met‑AuNCs溶液。

步骤2.MnO2纳米花的合成：

首先，将1.0g KMnO4和0.4g MnSO4与30mL去离子水充分搅拌溶解30分钟，然后在50mL不锈钢高压釜中，140℃下反应1小时，缓慢冷却至室温。取出离心，并用乙醇和水分别连续洗涤三次，最后将洗涤纯化后的产物在60℃的真空烘箱中进行干燥，得到MnO2纳米花固体。

步骤3.Au‑MnO2纳米花(NFs)与二抗(Ab2)的结合：将50mg上述制备的MnO2纳米花固体加到含有50mL去离子水的三口烧瓶中，然后将PVP(140mg)和1mL柠檬酸钠水溶液(1wt％)加入，并在剧烈搅拌下加热至沸腾。随后，80μL ‑

200mM AuCl4 (aq)缓慢加入到上述沸腾的溶液中并煮沸30分钟。离心，得到的MnO2‑Au沉淀，使用乙醇、去离子水洗涤三次，然后在60℃下烘干，得到MnO2‑Au纳米花粉末。取0.2mg MnO2‑Au粉末加入到100μL PBS中混匀，随后加入50μL Ab2(200μg/mL)溶液并在4℃下搅拌过夜，使用50μL 1％的牛血清蛋白在4℃下反应1小时来封闭非特异性识别位点，离心分离并洗涤去除未结合的牛血清蛋白，最后所得的Ab2‑MnO2‑Au NFs分散在100μL PBS(0.1M,pH 7.4)中。

步骤4.基于滚环放大反应(RCA)及ALP催化AAP原位产生AA:

2μL环模板(序列为P‑CTACTACCTCATTTCCCGGTACCCACCCAGTCCACCCCCACATTTTAACTATACAAC)、6μL不同浓度的靶(let‑7a，序列为：UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)、120U T4 DNA和3μL 

10×T4 DNA buffer充分混合并在37℃恒温振荡器中反应1h，随后加入5μL dNTPs(10mmol)、3U phi29 DNA聚合酶和3μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，37℃恒温振荡器中反应3h以上，最后在75℃中孵育20分钟灭活。上述滚环放大产物与6μL CdSe‑DNA探针(DNA序列为：TACCCACCCAGTCCACCCCCACATGCCCCTTATCCAGCCT‑NH2和6μL Biotin‑DNA(序列为：AACTATACAACCTACTACCTCAGGAACTCTCTAATCGCTAACCC‑biotin)探针在37℃下杂交1小时，随后加入10μL 1:100的ALP‑Streptavidin(链霉亲合素)溶液在37℃下孵育1小时，随后将上述溶液离心并重新分散至30μL水溶液(以除去多余杂质)。为进行酶促反应：将30μL 4mmol AAP溶液与上述溶液混合，并在避光处于37℃反应30分钟得AA溶液。

步骤4.ECL传感器的制备：

将10μL纯化的AuNCs修饰在预处理的玻碳电极表面，并在黑暗中干燥。然后，将10μL 

0.026mol/L的3,4‑噻吩二羧酸、10μL Ab1溶液(200μg/mL)，依次滴加到电极表面，并在4℃下孵育1.5小时。然后加入10μL不同浓度的前列腺抗原，4℃下孵育2小时，再与10μL Ab2‑Au‑MnO2 NFs(ECL信号淬灭探针)形成免疫复合物，构建了ECL免疫传感器，检测ECL“off”信‑1

号。再将固定抗原浓度(10ng mL )测定ECL的电极插入目标二(不同浓度Let‑7a miRNA)引

2+

发扩增反应产生的AA溶液中，反应4分钟，MnO2被AA还原为Mn ，由此成功构建ECL“on”的传感平台，用于Let‑7a miRNA检测。

步骤5.ECL检测：

利用MPI‑E电化学发光仪器，在200mM,pH 7.4(含有20mM TPA)的缓冲溶液中进行ECL检测，电位扫描范围是0.4V～1.0V，光电倍增管(PMT)是900V。