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专利号: 2021105281124
申请人: 江苏大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测转基因作物中Cry1Ab蛋白的原位比率光电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤如下:(1)制备CdTe QDs/Au NRs纳米复合材料,备用;

(2)利用CdSe QDs的羧基与含有氨基的二抗(Ab2)及双链DNA(dsDNA)通过酰胺反应制备Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA材料,备用;

(3)氧化铟锡玻璃(ITO)电极经预处理后,备用;

(4)将步骤(1)制备的CdTe QDs/Au NRs纳米复合材料修饰到步骤(3)预处理的氧化铟锡玻璃电极表面,并在室温下干燥,此时,产品标记为CdTe QDs/Au NRs/ITO;

(5)将活化试剂EDC/NHS修饰在步骤(4)所制得的传感器表面,以活化CdTe QDs表面的羧基;随后将Cry1Ab的一抗(Ab1)修饰在电极表面,并在一定温度下孵育一段时间,之后用PBS对产品进行清洗,此时,产品标记为Ab1/CdTe QDs/Au NRs/ITO;

(6)将牛血清白蛋白(BSA)和不同浓度的Cry1Ab蛋白依次修饰在步骤(5)所获得的传感器表面,之后用PBS对产品进行清洗,此时,产品标记为Cry1Ab/BSA/Ab1/CdTe QDs/Au NRs/ITO;

(7)将步骤(2)制备的Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA材料修饰到步骤(6)所制得的传感器表面,并在一定温度下孵育一段时间,之后用PBS对产品进行清洗,此时,产品标记为Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA/Cry1Ab/BSA/Ab1/CdTe QDs/Au NRs/ITO;

(8)将步骤(7)所制得的传感器浸泡在亚甲基蓝(MB)一段时间,之后用PBS对产品进行清洗,此时,产品标记为MB/Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA/Cry1Ab/BSA/Ab1/CdTe QDs/Au NRs/ITO;

以此,获得高灵敏检测Cry1Ab蛋白的原位比率光电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,利用静电吸附制备CdTe QDs/Au NRs复合材料:将2μM CdTe QDs与0.1‑0.3nM Au NRs等体积混合,搅拌4h后得到CdTe QDs/Au NRs复合材料。

3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,

S1,采用水热法制备CdSe QDs:

将1.7g Na2SO3溶解于50mL超纯水中;然后将溶液转移至100mL三口烧瓶中,通氮气

30min,在搅拌下加热升温至90℃;然后,向三口烧瓶中加入0.6g硒粉,持续通氮气,冷却回流5h,过滤得到浅黄色的Na2SeO3前驱体;将0.20M,0.80mL CdCl2溶液,72.5mg HMP,34.6μL MPA加入到50mL超纯水中,用6.0M NaOH溶液调节pH至9.0,然后加入20.0mM,0.80mL Na2SeO3前驱体,100℃下回流10min;然后向溶液中加入3.67mL N2H4·H2O,在100℃下继续回流10h,用异丙醇对产物进行离心洗涤三次,最后将CdSe QDs重新分散到超纯水中,在4℃下保存备用;

S2,利用CdSe QDs的羧基与含有氨基的二抗(Ab2)及双链DNA(dsDNA)通过酰胺反应合成Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA;具体为:首先,将等体积2μM DNA1与2μM DNA2在37℃下反应1h,形成dsDNA;然后,取200μL 10mM PBS加入到1mL 20μM CdSe QDs溶液中,达到活化羧基的目的;其中,PBS的pH=7.4,含有

10mM EDC和5mM NHS;室温下混合搅拌15min后,依次加入300μL dsDNA和300μL 12μM Ab2溶液,避光继续搅拌4h,在7000rpm下离心5min后,加入相同体积超纯水溶解,得到Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA。

4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,将直径为6mm氧化铟锡玻璃电极在1M NaOH溶液中煮沸20min,然后依次在无水乙醇和超纯水中超声15min,最后在空气中干燥。

5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,CdTe QDs/Au NRs的用量为20μL。

6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,EDC浓度为0.01M,NHS浓度‑1为0.002M,EDC/NHS混合溶液用量为10μL;Ab1浓度为6‑14μg·mL ,用量为10μL;反应温度为

37℃,反应时间为2h。

7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(6)中,BSA含量为1%,用量为10μ‑1L,反应时间为60min;Cry1Ab浓度为0.01‑100ng·mL ,用量为10μL,反应温度为37℃,反应时间为90min。

8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(7)中,Ab2‑CdSe QDs‑dsDNA用量为10μL,反应温度为37℃,反应时间为60min。

9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(8)中,MB浓度为10μM,吸附时间为10min。

10.将权利要求1~9任一项所述制备方法制备的原位比率光电化学传感器用于实际样品玉米或小麦作物中Cry1Ab蛋白的分析检测,具体检测步骤为:将1g玉米粉或小麦粉与10mL 0.1M PBS溶液混合,其中,PBS中含0.2%BSA和0.1%Tween‑20;以150rpm的频率在孵育箱中摇动1h;然后,在8000rpm离心10分钟后,将所得提取‑1物用0.1M PBS稀释10倍得提取液,分别将1mL的浓度为2、6或20ng·mL 的Cry1Ab蛋白加入

1mL提取液中进行免疫传感器检测。