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专利号: 2021105120090
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高产D‑泛酸的基因工程菌,由如下方法构建获得:(1)以E.coli DPA8为底盘菌,将其基因组中的poxB基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB,记为DPA8‑1;

(2)敲除菌株DPA8△poxB中的pta基因,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta,记为DPA8‑2;

(3)将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA,记为DPA8‑3;

(4)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB,记为DPAN9;

(5)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA,记为DPAN10;

(6)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因(G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*,记为DPAN10‑1;

(7)菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因(G41A+C50T)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*,记为DPAN10‑2或者DPAN11;

(8)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/Trc‑pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)替换并使用trc启动子替换原生启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA//ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*,记为DPAN12;

(9)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/Trc‑pykF/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd,记为DPAN13;

(10)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/trc‑spoT*/trc‑lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD,记为DPAN14;

(11)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD基因组中的lacI基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD/△lacI,记为DPAN15,即所述高产D‑泛酸的基因工程菌。。

2.构建权利要求1所述高产D‑泛酸的基因工程菌的方法,其特征在于所述方法如下:(1)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将底盘菌E.coli DPA8基因组中的poxB基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB,记为DPA8‑1;

(2)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,敲除菌株DPA8△poxB中的pta基因,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta,记为DPA8‑2;

(3)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA,记为DPA8‑3;

(4)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB,记为DPAN9;

(5)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA,记为DPAN10;

(6)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因(G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*,记为DPAN10‑1;

(7)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因(G41A+C50T)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*,记为或者DPAN11;

(8)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△glk/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/Trc‑pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)替换并使用trc启动子替换原生启动子,得到重组菌株DPA8△glk/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA//ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*,记为DPAN12;

(9)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/Trc‑pykF/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd,记为DPAN13;

(10)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/trc‑spoT*/trc‑lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD,记为DPAN14;

(11)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD基因组中的lacI基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc‑pykA/ilvN*/ilvH*/Trc‑spoT*/Trc‑lpd/Trc‑ilvD/△lacI,记为DPAN15,即所述高产D‑泛酸的基因工程菌。

3.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述底盘菌E.coli DPA8由如下方法构建获得:

(1)以Escherichia.coli W3110为出发菌株,运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将出发菌株Escherichia.coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panC,记为DPA1;

(2)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanE,记为DPA2;

(3)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanEpanB,记为DPA3;

(4)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanEpanBilvC,记为DPA4;

(5)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、

980位分别引入碱基A、T,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanEpanBilvC/ilvG*,记为DPA5;

(6)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA,记为DPA6;

(7)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG突变为GTG,得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc‑panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*,记为DPA7;

(8)运用CRISPR‑Cas9基因编辑技术,将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG突变为GTG,得到重组菌株Escherichia.coliW3110/Trc‑panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*,记为DPA8。

4.权利要求2所述方法,其特征在于所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求1所述高产D‑泛酸的基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述高产D‑泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中,于28~30℃、150~200rpm条件下进行发酵培养至OD600=0.8~1.0,添加终浓度为0.1mM的IPTG,继续培养至48h,发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D‑泛酸;所述发酵培养基组成如下:葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~20g/L、磷酸二氢钾0.5~

1.5g/L、硫酸镁0.1~1.0g/L、酵母提取物1~3g/L、碳酸钙5~20g/L,0.5~2ml/L微量金属盐溶液,溶剂为去离子水;微量金属盐溶液组成为:10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O,溶剂为去离子水。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母提取物2g/L、碳酸钙10g/L,1ml/L微量金属盐溶液,溶剂为去离子水。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖24g/L、硫酸铵12g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母提取物2g/L、碳酸钙10g/L,1ml/L微量金属盐溶液,溶剂为去离子水。