欢迎来到利索能及~ 联系电话:18621327849
利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2021104542201
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种基于核酸适配体耦合球型核酸的邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯的荧光检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

将可变构核酸适配体与待测样品混合均匀,恒温反应30~60min;再加入限制性内切酶与球型核酸,10~20min后测定荧光信号值的变化,检测待测样品中邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯的含量;

所述可变构核酸适配体为茎环结构,包括“自由足”域和DEHP适配体域,可变构核酸适配体的碱基序列为:(5’‑3’)CCTCAGCAACGCATAGGGTGCGACCACATACGCCCCATGTATGTCCCTTGGTTGTGCCCTATGCGTCCTCAGCA,碱基序列下划线部分为“自由足”域,其余部分为DEHP适配体域;

所述球型核酸是以金纳米粒子为核,功能性寡核苷酸链为壳,功能性寡核苷酸链的碱基序列为:(5’‑3’)SH‑TTTTTTTTTTGC*TGAGGAT‑TAMRA,*为裂解位点,TAMRA为荧光基团,‑SH为巯基。

2.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述恒温反应的温度为35~40℃。

3.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述限制性内切酶为Nt.BbvCI。

4.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述可变构核酸适配体在最终反应体系中的终浓度为1~5nM。

5.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述限制性内切酶在最终反应体系中的终浓度为0.1~0.5U/μL。

6.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述球型核酸在最终反应体系中的终浓度为2‑10nM。

7.如权利要求1所述的荧光检测方法,其特征在于,所述球型核酸的制备方法,包括如下步骤:

(1)金纳米粒子的制备

在反应器中,于剧烈搅拌下加热1wt%的HAuCl4溶液至沸腾,然后向其中加入30~40mM的柠檬酸钠溶液,剧烈搅拌,并反应10~20min,待溶液由纯黄色变为酒红色,移去热源,持续冷却至室温,得金纳米粒子溶液,于4℃避光保存备用;其中HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为(100~200):(3~5);

(2)球型核酸的制备

将功能性寡核苷酸链溶解于二硫苏糖醇磷酸缓冲液(pH=8)中,室温静置2~3h,然后用NAP‑5柱洗脱除杂;将除杂后的50μM功能性寡核苷酸链与步骤(1)100μL金纳米粒子溶液混合,室温放置12h,加入20μL 3M NaCl溶液缓慢混合,10s超声处理,重复5次,间隔1h;室温放置24h;12000rpm离心30min,分离得到球型核酸,采用含有0.01%吐温20的PBS缓冲液洗涤3次后,分散于PBS缓冲液中,放置于4℃避光保存备用。

8.如权利要求7所述的荧光检测方法,其特征在于,步骤(2)中所述二硫苏糖醇磷酸缓冲液为二硫苏糖醇、Na2HPO4和KH2PO4的水溶液,其中,二硫苏糖醇浓度为0.45mM,Na2HPO4浓度为6.31mM,KH2PO4浓度为0.35mM。

9.如权利要求7所述的荧光检测方法,其特征在于,步骤(2)中所述PBS缓冲液(pH=7)的配方为:0.1mol/LKH2PO4溶液和0.1mol/L Na2HPO4溶液,按照4:6的体积比混合均匀。

10.如权利要求7所述的荧光检测方法,其特征在于,采用标准加入法或标准曲线法检测待测样品中邻苯二甲酸二(2‑乙基)己酯的含量。