1.一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器在制备半胱天冬酶抑制剂筛选的检测试剂盒中的应用；

所述外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，其包括信号探针@纳米金结构和检测探针；信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；信号探针@纳米金结构由信号探针与纳米金溶液混合得到，信号探针通过Au‑S键连接在纳米金上；检测探针可组装在由链霉亲和素包覆的磁珠上构成探针‑磁珠结构；

检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，以此实现外切酶III对纳米金表面信号探针的循环切割，从而循环释放出荧光分子；

所述半胱天冬酶为半胱天冬酶‑8和半胱天冬酶‑9；

所述信号探针包括信号探针1和信号探针2，所述检测探针包含检测探针1和检测探针

2；

其中，检测探针1中包含半胱天冬酶‑8的识别位点Ile‑Glu‑Thr‑Asp和DNA触发链1，检测探针2中包含半胱天冬酶‑9的识别位点Leu‑Glu‑His‑Asp和DNA触发链2；

DNA触发链1与信号探针1序列互补，DNA触发链2与信号探针2序列互补；DNA触发链1和DNA触发链2的3’末端包含免于被外切酶III消化的保护序列区；

所述荧光分子为Cy5分子和Texas Red分子，其分别被包含在信号探针1和信号探针2上；

所述检测探针1的结构为：生物素‑(COOH)‑Lys‑Ser‑His‑Ser‑His‑Gly‑Asp‑Thr‑Glu‑Ile‑Cys‑(NH2)‑TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys‑Ile‑Glu‑Thr‑Asp‑Gly‑His‑Ser‑His‑Ser‑Lys‑生物素（SEQ ID No. 

1），DNA部分核酸序列为（5’‑3’）：TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT（SEQ ID No. 2）；

检测探针2的结构为：生物素‑(COOH)‑Lys‑Arg‑Gly‑Arg‑Gly‑Gly‑Asp‑His‑Glu‑Leu‑Cys‑(NH2)‑TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys‑Leu‑Glu‑His‑Asp‑Gly‑Gly‑Arg‑Gly‑Arg‑Lys‑生物素（SEQ ID No. 3），DNA部分核酸序列为（5’‑3’）：TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT（SEQ ID No. 4）；

所述信号探针1的序列为（5’‑3’）：SH‑TTT TTT TTT TGT GTT AGC CTC AAG TG‑Cy5（SEQ ID No. 9）；信号探针2的序列为（5’‑3’）：SH‑TTT TTT TTT TCG ATA GTC CGA TTG TG‑Texas Red（SEQ ID No. 10）。

2.一种检测半胱天冬酶及其活性的方法，其采用权利要求1所述的检测试剂盒，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的；

半胱天冬酶活性检测的步骤包括两步，分别为半胱天冬酶对检测探针的裂解和外切酶III驱动的三维DNA纳米机器导致的荧光分子的循环释放；

半胱天冬酶对检测探针的裂解在20微升的反应体系中进行，反应体系包含11.5微升的

1×磷酸盐缓冲溶液、8微升的检测探针‑磁珠和0.5个单位的半胱天冬酶‑8或/和半胱天冬酶‑9，在37摄氏度的温度下孵育1个小时；经过磁分离后，取含有裂解产物的上清液进行下一步反应；第二步外切酶III驱动的三维DNA步行器的反应体系为20微升，其中包含1×Cutsmart缓冲液，上步反应的上清液，0.71微升的信号探针1@纳米金或0.36微升的信号探针2@纳米金，以及0.5个单位的外切酶III，将以上混合物在200微升的离心管中混匀后置于

37摄氏度孵育1小时；

室温下，使用110伏的恒定电压，在1倍工作浓度的TBE缓冲液中通过12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析半胱天冬酶‑8和半胱天冬酶‑9的酶切产物；电泳时间为60分钟；凝胶电泳中使用的染料为SYBR Gold，通过伯乐ChemiDoc MP成像系统对胶图进行拍摄分析；

半胱天冬酶‑8的最终反应产物用成像缓冲液稀释200倍，半胱天冬酶‑9的最终反应产物用成像缓冲液稀释500倍；用移液枪取10微升稀释溶液滴到载玻片上使用全内反射荧光显微镜进行单分子成像，Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子分别使用640纳米的激光器和

561纳米的激光器进行激发，信号由100×的奥林巴斯油镜进行收集，并由安道尔Ixon DU897 EMCCD以500毫秒的曝光时间进行成像，利用Image J软件选择600像素×600像素的图像区域分别对Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子进行计数。

3.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述1×

Cutsmart缓冲液为500毫摩尔每升的醋酸钾，200毫摩尔每升的三羟基氨甲烷‑醋酸，100毫摩尔每升的醋酸镁，1000微克每毫升的BSA，pH7.9。

4.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述1倍工作浓度的TBE缓冲液含9毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、9毫摩尔每升的硼酸和0.2毫摩尔每升pH=7.9的乙二胺四乙酸。

5.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述成像缓冲液含1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.4%的D‑葡萄糖、0.04%毫克每毫升的过氧化氢酶、50微克每毫升的牛血清蛋白、67毫摩尔每升的甘氨酸‑氢氧化钾、1毫克每毫升的水溶性维生素E、

2.5毫克每毫升的氯化镁，pH9.4。