利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2021102921186
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种利用新型强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法,其特征在于所述方法由下述步骤组成:

(1)构建质粒pJN44‑TYR1’‑ARO10’‑ADH’‑HpaBC’合成含有TDH3启动子突变体P’TDH3的预苯酸脱氢酶基因TYR1表达盒P’TDH3‑TYR1‑Ter、苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10表达盒P’TDH3‑ARO10‑Ter、醇脱氢酶基因ADH表达盒P’TDH3‑ADH‑Ter、

4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶基因HpaBC表达盒P’TDH3‑HpaBC‑Ter,将这四个表达盒依次连接至pJN44载体上,形成表达质粒pJN44‑TYR1’‑ARO10’‑ADH’‑HpaBC’;

上述TDH3启动子突变体P’TDH3的序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中任意一种;

上述表达盒中的Ter选用的是T7终止子,其基因序列为:caaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctag;

(2)构建重组解脂亚罗酵母菌

提取解脂亚罗酵母菌基因组,通过PCR获得其基因组上POX3整合位点的上下游同源臂,进而构建质粒pURA‑POX3 L&R;将质粒pJN44‑TYR1’‑ARO10’‑ADH’‑HpaBC’中含目的基因的表达盒连接至质粒pURA‑POX3 L&R上,构建质粒pURA‑POX3 L&R‑TYR1’‑ARO10’‑ADH’‑HpaBC’,将所得质粒转化进入解脂亚罗酵母菌,得到重组解脂亚罗酵母菌。

2.根据权利要求1所述的利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中,预苯酸脱氢酶基因TYR1的Gene ID为2909038、苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10的Gene ID为2910787、醇脱氢酶基因ADH的Gene ID为2910787、4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶基因HpaBC的Gene ID为60901904。

3.根据权利要求1或2所述的利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中,在四个表达盒的两端分别添加SpeI和XbaI酶切位点,并利用限制性内切酶SpeI和XbaⅠ分别对P’TDH3‑TYR1‑Ter、P’TDH3‑ARO10‑Ter、P’TDH3‑ADH‑Ter、P’TDH3‑HpaBC‑Ter进行双酶切,然后连接至pJN44载体上,构建质粒pJN44‑TYR1’‑ARO10’‑ADH’‑HpaBC’。

4.根据权利要求1所述的利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中,以TDH3启动子基因序列为模板,经易错PCR得到TDH3启动子突变体P’TDH3集合;经重叠PCR方法,将P’TDH3和EGFP融合,构建P’TDH3‑EGFP表达盒;将此表达盒插入pJN44,进而在解脂亚罗酵母菌表达,构建TDH3启动子突变体库;通过荧光酶标仪检测重组菌的酵母增强型绿色荧光蛋白pEGFP荧光强度,筛选出基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.44中任意一种的TDH3启动子突变体。

5.根据权利要求1所述的利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中,所述TDH3启动子突变体P’TDH3的碱基序列为SEQ ID No.2所示。