1.一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1‑1)过表达质粒的构建：将几丁质酶基因连接到pCT74载体ToxA启动子下，转染入枫香拟茎点霉中，在含有潮霉素抗性的PDA中培养获得过表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；

(2)吸取枫香拟茎点霉野生型菌株菌液2mL接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、‑1

180r·min 条件下培养36h；

(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入‑1

10mL酶解液中，28℃、80r·min 酶解13h；

(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL

7 8 ‑1

离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为10～10个·mL ，得到原生质体；

(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1‑1)制得的过表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；

‑1

(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入潮霉素至终浓度50μg·mL ，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。

2.一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1‑2)整合表达质粒的构建：将几丁质酶基因采用CRISPR‑Cas9的方法置于选定高表达基因启动子之后构建整合表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；

(2)吸取枫香拟茎点霉△Ku70菌株菌液接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·‑1

min 条件下培养36h；

(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入‑1

10mL酶解液中，28℃、80r·min 酶解13h；

(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL

7 8 ‑1

离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为10～10个·mL ，得到原生质体；

(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1‑2)制得的整合表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；

‑1

(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入苯菌灵至终浓度0.5μg·mL ，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。

3.根据权利要求1所述的一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，步骤(1‑1)所述过表达质粒的构建方法如下：(a)采用限制性内切酶NcoI消化质粒pCT74，获得表达载体的骨架结构，载体上由于NcoI限制性内切酶切割导致丢失的HygR‑ToxA片段以pCT74为模板进行克隆回补，引物为：F‑HT及R‑HT；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F‑Chi及R‑Chi；

所述F‑HT具有如SEQ ID No.2所示的序列；

所述R‑HT具有如SEQ ID No.3所示的序列；

所述F‑Chi具有如SEQ ID No.4所示的序列；

所述R‑Chi具有如SEQ ID No.5所示的序列；

(b)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：几丁质酶基因片段：HygR‑ToxA片段按5:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min；连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。

4.根据权利要求2所述的一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，步骤(1‑2)所述整合表达质粒的构建方法如下：(A)采用限制性内切酶SalI消化质粒pCT74‑Cas9‑sgRNA，获得整合载体的骨架结构；左右两条同源臂从基因组上获取，引物分别为：F‑LA:R‑LA，F‑RA:R‑RA；苯菌灵抗性片段从质粒pBen‑RFP上获取，引物为：F‑Ben，R‑Ben；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F‑ChiB及R‑ChiB；所述F‑LA具有如SEQ ID No.8所示的序列；

所述R‑LA具有如SEQ ID No.9所示的序列；

所述F‑RA具有如SEQ ID No.10所示的序列；

所述R‑RA具有如SEQ ID No.11所示的序列；

所述F‑Ben具有如SEQ ID No.12所示的序列；

所述R‑Ben具有如SEQ ID No.13所示的序列；

所述F‑ChiB具有如SEQ ID No.14所示的序列；

所述R‑ChiB具有如SEQ ID No.15所示的序列；

(B)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：左同源臂：几丁质酶基因片段：右同源臂：苯菌灵抗性片段按5:1:1:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应

15min；连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；

加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。

5.权利要求1‑4任一项所述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在拮抗镰刀菌上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在MSM培养基上培养几丁质酶工程菌，在PDA培养基上镰刀菌；平板对峙实验时，过表达菌株两株和整合表达菌株一株，及枫香拟茎点霉野生型菌株一株能够拮抗平板中镰刀菌的生长。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述MSM培养基成分为：2.0g NaNO3，1.31g K2HPO4·3H2O，0.5g KCl，1.0g MgSO4·7H2O，0.018g FeSO4·7H2O，1.12mg MnSO4，0.078mg CuSO4·5H2O，15g蔗糖，20mL几丁质胶体，25g琼脂；所述镰刀菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌或禾谷镰刀菌。

8.权利要求1‑4任一项所述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在抗小麦赤霉病中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，小麦种子使用1％过氧化氢消毒后置于无菌蛭石中，滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株，18℃光照培养10天后，取其根部，表面处理及消毒后，可检测到内生真菌在小麦根部的定殖。

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10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，小麦培养至4天时，每株滴加浓度1×10禾谷镰刀菌孢子悬液0.5mL，继续培养至10天时，每株滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株1％0.5mL；继续培养10天后，可检测到几丁质酶菌株对小麦赤霉病病原菌的抗性作用。