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专利号: 2021100495517
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-11-13
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器,其特征是,包括限制性核酸内切酶HpaII、含有AP位点的信号探针、核酸内切酶IV和链霉亲和素修饰的磁珠;所述信号探针由生物素和Cy5共同修饰。

2.如权利要求1所述的一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器,其特征是,甲基化的DNAm

的序列为5’‑GCT GCT TCC GGC TGG TGC‑3’m

3’‑CGA CGA AGG  CCG ACC ACG‑5’m

其中,加粗的 C是甲基化位点。

3.如权利要求1所述的一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器,其特征是,信号探针的序列为Biotin‑AAA AAA AAA AGC ACC AGC CXG AAG CAG C‑Cy5,其中X为无碱基位点即AP位点。

4.一种检测DNA甲基化检测试剂盒,其特征是,所述试剂盒包括限制性内切酶HpaII、10×Cutsmart缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、生物素和Cy5共修饰的含有AP位点的信号探针、链霉亲和素修饰的磁珠、1×B&W缓冲液、10×NEB缓冲液3、核酸内切酶Ⅳ。

5.如权利要求5所述的一种检测DNA甲基化检测试剂盒,其特征是,所述10×Cutsmart缓冲液包括500毫摩尔醋酸钾(KAc),200毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷‑醋酸(Tris‑Ac),100毫摩尔醋酸镁(Mg(Ac)2;

1×B&W缓冲液包括5毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷‑盐酸(Tris‑HCl),500微摩尔乙二胺四乙酸(EDTA),1摩尔氯化钠(NaCl),pH 7.5;

10×NEB缓冲液3包括1摩尔氯化钠(NaCl),500毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷‑盐酸(Tris‑HCl),100毫摩尔氯化镁(MgCl2),10毫摩尔二硫苏糖醇(DTT),pH7.9。

6.一种检测DNA甲基化的方法,其特征是,所述方法包括:限制性核酸内切酶HpaII切割甲基化状态的DNA得到单链DNA,单链DNA与含有AP位点的信号探针形成双链体,并通过生物素‑链霉亲和素的相互作用,将双链体捕获到磁珠表面,添加核酸内切酶IV以裂解双链体中的AP位点,释放Cy5标记的裂解信号探针和单链DNA。

7.如权利要求6所述的一种检测DNA甲基化的方法,其特征是,形成双链体的具体过程包括:将甲基化的DNA的序列、限制性内切酶HpaII混合物,进行第一次孵育,第一次孵育完成后,将生物素修饰的信号探针添加到反应混合物中,进行第二次孵育,第二次孵育完成后,缓慢冷却至室温以形成双链体。

8.如权利要求6所述的一种检测DNA甲基化的方法,其特征是,第一次孵育的温度为30‑45℃,优选的,为37℃;

进一步地,第一次孵育的时间为60‑100min,优选的,为80min;

进一步地,第二次孵育的温度使90‑105℃,优选的,为95℃;

进一步地,第二次孵育的时间为3‑8min,优选的,为5min。

9.如权利要求6所述的一种检测DNA甲基化的方法,其特征是,将链霉亲和素偶联的超顺磁珠添加到含有双链体的反应混合物中,在室温下进行第三次孵育,双链体通过生物素与链霉亲和素的相互作用连接到磁珠表面;

或,所述第三次孵育的时间为10‑25min,优选的,为15min;

进一步地,将双链体捕获到磁珠表面之后,对磁珠进行洗涤,以去除未偶联的探针;

进一步地,磁珠洗涤之后,将磁珠重悬于含有核酸内切酶Ⅳ的反应混合物中,进行第四次孵育;

或,所述第四次孵育的温度为30‑45℃,优选的,为37℃;

或,所述第四次孵育的时间为1‑3h;优选的,为1h;

进一步地,第四次孵育完成后,通过磁分离除去未释放的信号探针,对上清液进行单分子检测。

10.权利要求1‑3任一项所述的一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器或权利要求4或5所述的检测DNA甲基化检测试剂盒或权利要求6‑9任一项所述的检测DNA甲基化的方法在检测DNA甲基化领域中的应用。