1.一种高产L‑甲硫氨酸的基因工程菌,由如下方法构建:(1)以E.coli W3110 M2/pAm为出发菌株,在质粒上过表达metF基因,得到工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF;
(2)将工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY)/pAm metF;
(3)将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY)/pAm metF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY)/pAm metF;
(4)将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY)/pAm metF基因组中GCV基因的启动子替换为trc启动子,得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV)/pAm metF;
(5)将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY)基因组中glyA基因敲除,得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV△glyA),在质粒上过表达来自Arthrobacter sp.FB24的GlyA基因然后转化到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV)中得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyA metF,即为所述高产L‑甲硫酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的工程菌,其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC362(Escherichia coli ZJBSSC362),保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉大学,邮编:430072,保藏日期:2020年12月4日,保藏编号:CCTCC NO:M 2020846。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法,包括如下步骤:(1)以菌株E.coli W3110 M2/pAm为底盘菌株,在质粒上过表达大肠杆菌的metF基因,将质粒转化到E.coli W3110 M2中得到工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF;
(2)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将将工程菌E.coli W3110 M2/pAm metF基因组中fliY基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY)/pAm metF;
(3)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY)/pAm metF基因组中malY基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coli W3110 M2 (trc‑fliY malY)/pAm metF;
(4)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY)/pAm metF基因组中GCV基因的启动子替换为trc启动子,得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV)/pAm metF;
(5)应用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY)基因组中glyA基因敲除,得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV△glyA),在质粒上过表达来自Arthrobacter sp.FB24的GlyA基因然后转化到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV)中得到E.coli W3110 M2(trc‑fliY malY GCV△glyA)/pAm GlyA metF,即为所述高产L‑甲硫酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述Arthrobacter sp.FB24的glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求所述基因工程菌在微生物发酵制备L‑甲硫氨酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养,发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L‑甲硫氨酸。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖10g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O3 2g/L、酵母提取物2g/L,1ml/L微量元素溶液,溶剂为去离子水,pH值自然,接种时补加CaCO30.3μg/L,VB12 0.2μg/L,赖氨酸10μg/L;微量元素溶液组成为:500g/L MgSO4·7H20,5g/L FeSO4·7H2O,5g/L MnSO4·8H20,5g/L ZnSO4,溶剂为去离子水。