1.一种纤维小体对接蛋白突变体36741,其特征在于,一种纤维小体对接蛋白DocA,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,进行定点突变,获得活性提高的对接蛋白突变体36741,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种纤维小体对接蛋白突变体36741为一种纤维小体对接蛋白DocA,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,进行定点突变,获得活性提高的对接蛋白突变体36741,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1-2任一项所述对接蛋白突变体36741的制备方法,其特征在与,包括如下步骤:以上述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,进行定点突变,获得对接蛋白突变体36741,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础,设计定点突变引物,以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板,进行PCR,构建重组突变质粒,并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,挑选阳性克隆进行发酵,发酵结束后收集菌体,对菌体进行破碎,纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。
4.如权利要求3所述制备方法,其特征在于,由对接蛋白,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,突变为对接蛋白突变体36741,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述制备方法,其特征在于,发酵结束后离心收集菌体,对菌体进行超声破碎,经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。
6.如权利要求3所述制备方法,其特征在于,对接蛋白突变体36741的PCR扩增引物核苷酸序列如下:
36741-F如SEQ ID NO.7所示;
36741-R如SEQ ID NO.8所示。
7.如权利要求6所述制备方法,其特征在于,PCR反应体系:
质粒载体模板1μL,正向突变引物F 2μL,反向突变引物R 2μL,5×FastAlteration Buffer 10μL,FastAlteration DNA Polymerase 1μL,ddH2O34μL。
8.如权利要求7所述制备方法,其特征在于,PCR反应条件:
95℃预变性2min;94℃20sec,55℃10sec,68℃3min,18个循环;补充延伸68℃5min;
优选的,PCR反应完成后,需要用Dnp I酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化,消化反应体系混匀后,将其于37℃条件下消化1h,获得待转化载体;
优选的,所述消化体系:
PCR扩增产物40μL,Dnp I酶1μL;
优选的,突变载体的转化,将上述待转化载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·mL-1)的LB固体培养基上,37℃过夜培养后,挑取单菌落,并进行测序验证,筛选阳性突变体,获得重组大肠杆菌36741-BL21;
优选的,突变体的表达、纯化,将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50μg·mL-1)的液体LB培养基中,37℃过夜培养,然后转接至液体LB培养基中37℃培养至OD600≈1时加入1μm·mL-1的IPTG,于26℃、200rpm条件下诱导8h,收集诱导后的菌体,然后将菌体利用2ⅹPBS缓冲液重悬,利用超声波破碎,10000rpm离心10min,离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化,并使用PBS-EP+缓冲液透析除盐,获得纯化的纤维小体对接蛋白突变体36741。
9.权利要求1-2任一项所述对接蛋白突变体36741在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。
10.如权利要求9所述应用,其特征在于,所需钙离子的浓度为10-4M~10-2M。