1.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862,其特征在于,一种纤维小体对接蛋白DocA,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,进行定点突变,获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36862,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862,其特征在于,一种纤维小体对接蛋白DocA,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,进行定点突变,获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36862,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1-2任一项所述突变体36862的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:以上述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,进行定点突变,获得对接蛋白组合突变体36862,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础,设计定点突变引物,以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板,进行PCR,构建重组突变质粒,并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,挑选阳性克隆进行发酵,发酵结束后收集菌体,对菌体进行破碎,纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。
4.如权利要求3所述突变体36862的制备方法,其特征在于,所述制备方法中,由对接蛋白,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,突变为对接蛋白组合突变体36862,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述突变体36862的制备方法,其特征在于,发酵结束后离心收集菌体,对菌体进行超声破碎,经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。
6.如权利要求3所述突变体36862的制备方法,其特征在于,对接蛋白组合突变体36862的PCR扩增,将质粒分为AB段和BA段,AB段扩增引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12,BA段扩增引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11,使用所述扩增引物分别对AB段和BA段进行扩增。
7.如权利要求6所述突变体36862的制备方法,其特征在于,PCR反应体系:质粒DocA-pET28a载体模板1μL,正向突变引物F1/F2 2μL,反向突变引物R2/R1 2μL,2×Max Buffer25μL,dNTP 4μL,DNA Polymerase 1μL,ddH2O 15μL;
优选的,所述制备方法中,PCR反应条件:
95℃预变性3min;95℃ 15sec,60℃ 15sec,72℃ 3min,18个循环;补充延伸72℃
7min;
优选的,PCR反应完成后,需要用Dnp I酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化,消化反应体系混匀后,将其于37℃条件下消化2h;
优选的,所述消化体系:
PCR扩增产物40μL,Dnp I酶1μL;
优选的,将消化产物进行DNA凝胶电泳检测,检测后分别将AB段与BA段利用胶回收试剂盒进行回收优选的,将回收后的AB段与BA段利用Exnase II进行重组,反应产物为待转化载体,重组反应体系如下:ddH2O 10μL,5×CE II Buffer 4μL,AB段回收产物2μL,BA段回收产物2μL,Exnase II 2μL;
优选的,突变载体的转化,将上述待转化载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·mL-1)的LB固体培养基上,37℃过夜培养后,挑取单菌落,并进行测序验证,筛选阳性突变体,获得重组大肠杆菌36862-BL21;
优选的,突变体的表达、纯化,将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50μg·mL-
1)的液体LB培养基中,37℃过夜培养,然后转接至液体LB培养基中37℃培养至OD600≈1时加入至终浓度为1μm·mL-1的IPTG,于26℃、200rpm条件下诱导8h,收集诱导后的菌体,然后将菌体利用2ⅹPBS缓冲液重悬,利用超声波破碎,10000rpm离心10min,离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化,并使用PBS-EP+缓冲液透析除盐,获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36862。
8.权利要求1-2任一项所述突变体36862在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。
9.如权利要求8所述应用,其特征在于,所述对接蛋白组合突变体36862与黏连蛋白在低钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用;
进一步优选的,所述低钙离子浓度为10-7M-10-3M;
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进一步优选的,所述低钙离子浓度为10 M-10 M;
进一步优选的,所述低钙离子浓度为10-7M-10-6M。
10.如权利要求8所述应用,其特征在于,所述对接蛋白组合突变体36862与黏连蛋白在细胞内相互作用构建蛋白复合体中的应用。