1.一种腈水解酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第180位甘氨酸突变为天冬氨酸,同时将第205位丙氨酸突变为半胱氨酸。
2.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
3.一种由权利要求2所述腈水解酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化1‑氰基环己基乙腈制备1‑氰基环己基乙酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体,湿菌体固定化细胞或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂,以1‑氰基环己基乙腈为底物,以pH为4.0‑10.5、200M磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系,在20‑60℃、600rpm恒温水浴条件下反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得1‑氰基环己基乙酸。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述底物加入终浓度以反应体系体积计为5‑
1000mM;所述纯酶比酶活为160~170U/g,加入量以反应体系体积计为0.1‑3mg/mL;所述催化剂为湿菌体或固定化细胞时,用量以湿菌体重量计为10‑100g/L缓冲液。
7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中,37℃培养10‑12小时,按体积浓度1%的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基,37℃培养至培养液OD600为0.6‑0.8之间,加入终浓度为0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷,28℃诱导培养10小时,离心,收集菌体,用生理盐水清洗2次,得到湿菌体。
8.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述纯酶按如下方法制备:将含腈水解酶突变体编码基因工程菌湿菌体用含pH 7.0、100mM的NaH2PO4‑Na2HPO4缓冲液重悬,超声波破碎,破碎产物离心后取上清液作为粗酶液;所述超声波破碎条件为:400W,20min,1s破碎1s暂停;将粗酶液以1mL/min的流速通过经结合缓冲液冲洗的Ni‑NTA柱,用平衡缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白,流速为2mL/min;再用洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白,流速为2mL/min;最后将收集的目的蛋白以浓度为20mM的磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液为透析液进行透析,取截留液即为纯酶液;所述结合缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液,所述平衡缓冲液为含终浓度300mM NaCl和50mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液,所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和500mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液。