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专利号: 2020101265024
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-11-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法,所述方法包括:

(1)硅藻土改性:取适量天然硅藻土加入到2~3倍体积的5~6M的盐酸溶液中,充分反应后去离子水洗涤至中性,重新悬浮于H2SO4浓度60~80%、HNO3浓度10~20%的混合酸中,

40~50℃超声处理2~3h,冷却至室温,抽滤后用去离子水洗涤至中性。,得到氧化后的硅藻土加水搅拌制浆,置于马福炉中于500~600℃下焙烧2~3h,然后过滤、干燥、过筛制得到改性硅藻土,干燥储存备用;

(2)异构酶固定化:将含有葡萄糖异构酶的湿菌体用磷酸盐缓冲液悬浮,获得菌悬液;

向菌悬液中加入改性硅藻土,在室温、600~700rpm条件下水浴搅拌20~30min;再加入质量浓度3~5%的聚乙烯亚胺水溶液,在室温、600~700rpm条件下水浴搅拌交联0.5~2h;然后加入质量浓度5~10%的戊二醛水溶液,在室温、600~700rpm条件下水浴搅拌交联0.5~

2h,抽滤,滤饼用磷酸盐缓冲液清洗1~2次,粉碎,即获得葡萄糖异构酶固定化细胞;所述改性硅藻土与湿菌体质量之比为0.01~0.4:1。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)中硅藻土质量与混合酸体积之比为

1g:5~10mL。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)中聚乙烯亚胺水溶液用量为0.3~

0.7mL/g湿菌体。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)中戊二醛水溶液用量为0.1~2.0mL/g湿菌体。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述含有葡萄糖异构酶的湿菌体,是以SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因构建基因工程菌,再经活化培养、种子培养和发酵培养,于发酵液中获得。

6.如权利要求5所述的方法,其特征在于所述基因工程菌构建方法如下:将SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中,提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后,连接过夜,将连接产物导入宿主E.coliBL21(DE3)中,获得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI,即所述基因工程菌。

7.如权利要求5所述的方法,其特征在于所述湿菌体由如下方法获得:

(1)将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的斜面培养基,

37℃培养12h,获得斜面菌体;所述斜面培养基组成如下:10g/L蛋白胨,10g/L氯化钠,5g/L酵母粉,20g/L琼脂粉,溶剂为去离子水;

(2)将斜面菌体接种至含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基,37℃,150rpm培养8h,获得种子液;所述种子培养基组成如下:10g/L蛋白胨,10g/L氯化钠,5g/L酵母粉,溶剂为去离子水;

(3)将种子液以体积浓度1%接种量接种至发酵培养基,37℃、150rpm条件下培养至OD600达到0.6~0.8,然后加入终浓度0.1mM IPTG,28℃,150rpm条件下诱导11h,取发酵液离心,收集获得湿菌体;所述发酵培养基组成如下:10g/L蛋白胨,10g/L氯化钠,5g/L酵母粉,溶剂为去离子水。