1.一种利用显性黑色颖壳性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、培育黄颖双色选遗传工程核不育系;
S2、将包含显性黑色颖壳基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述黄颖双色选遗传工程核不育系的基因组中培育黑颖双色选遗传工程繁殖系;
S3、将所述S2中黑颖双色选遗传工程繁殖系与所述S1中黄颖双色选遗传工程核不育系混植,开花期将所述黑颖双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述黄颖遗传工程核不育系植株上,混收全部种子;
S4、根据颖壳颜色对所述S3中混收的全部种子进行第一次筛选,分离黄色颖壳种子和黑色颖壳种子;所述黄色颖壳种子为所述黄颖双色选遗传工程核不育系植株的后代;所述黑色颖壳种子为所述黑颖双色选遗传工程繁殖系植株的后代;
S5、根据胚乳是否发荧光对所述S4中分离的所述黄色颖壳种子进行第二次筛选,将混入的少量发荧光的繁殖系种子筛选出来,提纯黄颖双色选遗传工程核不育系种子;
所述S1中所述黄颖双色选遗传工程核不育系通过敲除黄色颖壳水稻的PTC1基因获得;
所述S2中所述育性恢复基因为PTC1,所述显性黑色颖壳基因为Bh4;所述花粉失活基因为ZMAA;所述荧光标记基因为DsRed。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S1中所述黄颖双色选遗传工程核不育系的培育方法为:
S1-A1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物1;
S1-A2、将所述靶位点接头引物1制成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1;
S1-A3、将所述双链接头PTC1-T1与载体连接得到pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体;
S1-A4、将所述pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-PTC1-T1敲除载体;
S1-A5、将所述pCas9-PTC1-T1敲除载体导入黄色颖壳水稻的愈伤组织中,转育成黄颖双色选遗传工程核不育系。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S1-A1中,所述靶位点接头引物1包括Seq2和Seq3,所述Seq2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示;所述Seq3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述S2具体为:S2-1、设计扩增显性黑色颖壳基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的引物,进行PCR扩增获得基因片段;
S2-2、将所述四个基因的基因片段构建到同一植物表达载体中得到四元连锁载体;
S2-3、将所述四元连锁载体导入到所述黄颖双色选遗传工程核不育系的基因组中获得转基因植株;
S2-4、从所述转基因植株中选择颖壳颜色为黑色且后代种子中50%为荧光种子的株系,即为黑颖双色选遗传工程繁殖系。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述显性黑色颖壳基因为Bh4,扩增所述Bh4基因的引物为Bh4-F和Bh4-R,所述Bh4-F的DNA序列如SEQ ID NO.7所示;所述Bh4-R的DNA序列如SEQ ID NO.8所示;
所述育性恢复基因为PTC1基因,扩增所述PTC1基因的引物为PTC1-F和PTC1-R,所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.10所示;所述PTC1-R的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;
扩增所述ZMAA基因的引物为ZMAA-F和ZMAA-R,所述ZMAA-F的DNA序列如SEQ ID NO.15所示;所述ZMAA-R的DNA序列如SEQ ID NO.16所示;
扩增所述DsRed基因的引物为DsRed-F和DsRed-R,所述DsRed-F的DNA序列如SEQ ID NO.20所示;所述DsRed-R的DNA序列如SEQ ID NO.21所示。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述S4中获得的黑颖种子经第二次荧光筛选,发荧光的黑颖种子发育成植株后为所述黑颖双色选遗传工程繁殖系,可继续用于下一代黄颖不育系种子的繁殖;不发荧光的黑颖种子发育成植株后颖壳颜色转变为黄色,可与黑颖繁殖系混植,继续用于繁殖下一代黄颖双色选遗传工程核不育系种子。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述S5中经第二次荧光筛选提纯的黄颖遗传工程核不育系种子与恢复系进行杂交制种。