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专利号: 2019106998902
申请人: 湖南杂交水稻研究中心
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系;

S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系;

S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植,开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上,混收全部种子;

S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选,将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来;所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子,所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株,所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株;

S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选,将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来,提纯异色颖壳不育系种子;

所述S1中所述双色选遗传工程核不育系通过敲除隐性异色颖壳的可育水稻的PTC1基因获得,所述隐性异性颖壳可育水稻材料中异色颖壳性状由OsCHI基因控制;

所述S2中所述黄颖基因为OsCHI,所述育性恢复基因为PTC1基因,所述花粉失活基因为ZMAA;所述荧光标记基因为DsRed。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述隐性异色颖壳可育水稻材料采用以下方法培育:通过编辑水稻野生型隐性颖壳颜色控制基因培育;或,通过回交方法导入突变的隐性颖壳颜色控制基因培育。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S1中所述隐性异色颖壳可育水稻材料的培育方法为:S1-A1、根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq2和Seq 3,所述Seq2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示;所述Seq 3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示;

S1-A2、将所述靶位点接头引物Seq2和Seq 3制成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1;

S1-A3、将所述双链接头OsCHI-T1与载体连接得到pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体;

S1-A4、将所述pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-OsCHI-T1敲除载体;

S1-A5、将所述pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化至水稻愈伤组织中,获得带有隐性异色颖壳的可育水稻。

4.根据权利要求1所述的方法 ,其特征在于,所述S1中所述双色选遗传工程核不育系采用以下方法获得:S1-B1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq7和Seq 8;所述Seq7的DNA序列如SEQ ID NO.7所示;所述Seq 8的DNA序列如SEQ ID NO.8所示;

S1-B2、将所述靶位点接头引物Seq7和Seq 8制成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1;

S1-B3、将所述双链接头PTC1-T1与载体连接得到pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体;

S1-B4、将所述pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-PTC1-T1敲除载体;

S1-B5、将所述pCas9-PTC1-T1敲除载体导入带有隐性异色颖壳的可育水稻的愈伤组织中,转育成双色选遗传工程核不育系。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S2具体为:

S2-1、设计扩增OsCHI基因、PTC1基因、ZMAA基因和DsRed基因的引物,进行PCR扩增获得基因片段;

S2-2、将所述四个基因的基因片段构建到同一植物表达载体中得到四元连锁载体;

S2-3、将所述四元连锁载体导入到所述双色选遗传工程核不育系的基因组中获得转基因植株;

S2-4、从所述转基因植株中选择颖壳颜色恢复为黄色且后代种子中50%为荧光种子的株系,即为双色选遗传工程繁殖系。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,扩增所述OsCHI基因的引物为CHI-F和CHI-R,所述CHI-F的DNA序列如SEQ ID NO.19所示;所述CHI-R的DNA序列如SEQ ID NO.20所示;

扩增所述PTC1基因的引物为PTC1-F和PTC1-R,所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.21所示;所述PTC1-R的DNA序列如SEQ ID NO.22所示;

扩增所述ZMAA基因的引物为ZMAA-F和ZMAA-R,所述ZMAA-F的DNA序列如SEQ ID NO.23所示;所述ZMAA-R的DNA序列如SEQ ID NO.24所示;

扩增所述DsRed基因的引物为DsRed-F和DsRed-R,所述DsRed-F的DNA序列如SEQ ID NO.25所示;所述DsRed-R的DNA序列如SEQ ID NO.26所示。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于,所述S4中经第一次荧光筛选获得的黄颖遗传工程繁殖系种子继续用于下一代不育系的繁殖。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于,所述S5中经第二次颖壳筛选获得的黄色颖壳不育系种子继续用于下一代不育系的繁殖;所述S5中经第二次颖壳筛选提纯的异色颖壳不育系种子与黄颖恢复系进行机械化制种。