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专利号: 2019104780448
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-05-22
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针;

所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点的富T单链DNA序列,所述信号探针5'端修饰有生物素,所述信号探针3'端修饰有荧光基团,优选使用AF488进行修饰;

优选的,所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合;

所述捕获探针用于捕获富集端粒,其具有与端粒杂交的单链DNA序列,所述捕获探针3'端进行生物素化修饰;

所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA序列,其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物。

2.如权利要求1所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器,其特征在于,所述信号探针的碱基序列如下:

5'-Biotin-TTT TTT TTT XTT TTT TTT-AF488-3';

其中X代表脱嘌呤嘧啶位点;

所述捕获探针的碱基序列如下:

CCT AAC CCT AAC CCT AAC CCT TTT-Biotin;

所述辅助探针的碱基序列如下:

5'-CCT AAC CCT AAC CCT AAddC-3';

优选的,所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。

3.如权利要求1或2任一项所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器,其特征在于,所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

4.基于权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法,其特征在于,所述方法包括:S1、用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA;

S2、加入捕获探针和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠孵育处理;

S3、加入TdT进行孵育处理;

S4、加入辅助探针、甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶进行孵育处理,;

S5、加入TdT、核酸内切酶IV和磁珠偶联信号探针进行孵育处理;

S6、磁分离后,对上清液进行单分子检测。

5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中,孵育处理条件为于90~100℃(优选95℃)温育3~8分钟(优选5分钟)。

6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S3中,孵育处理过程中还加入ddCTP;

孵育处理条件为于30~40℃(优选37℃)孵育20~40分钟(优选30分钟)。

7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S4中,孵育处理条件为30~40℃(优选为37℃)下孵育40~80分钟(优选为60分钟)。

8.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S5中,孵育处理条件为30~40℃(优选为37℃)下孵育40~80分钟(优选为60分钟)。

9.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S6中,采用全内反射荧光(TIRF)技术进行单分子检测;同时,通过荧光分光光度计测量反应产物的荧光光谱;具体为:在488nm的激发波长下测量AF488荧光,并使用532nm的荧光强度进行定量分析。

10.权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器和/或权利要求4-9任一项检测方法在检测端粒内氧化性损伤中的应用;优选的,所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。