1.一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体,其特征在于所述突变体为下列之一:(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺;(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第527位精氨酸突变为缬氨酸;(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺,且第527位精氨酸突变为缬氨酸。
2.一种权利要求1所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体构建的重组基因工程菌。
3.如权利要求2所述的工程菌,其特征在于所述工程菌按如下方法构建:将脱酰基酶突变体编码基因与强组成型启动子PermE*连接,并连接至表达质粒pSET152,转化进入E.coli JM109感受态,获得脱酰基酶突变体大肠杆菌克隆载体,提取质粒;将获得的重组质粒转化进入E.coli ET12567感受态,获得接合转移用大肠杆菌克隆载体;接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24,筛选阳性重组子,获得含脱酰基酶突变体基因的工程菌。
4.一种权利要求1所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体在生物催化棘白菌素B合成棘白菌素B母核中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的应用方法为:将含重组棘白菌素B脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的脱酰基酶突变体纯酶为催化剂,以棘白菌素B为底物,以甲醇为助溶剂构成反应体系,在35摄氏度、600转每分钟条件下进行反应,反应结束,反应液分离纯化,获得棘白菌素B母核。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述反应体系中,棘白菌素B终浓度为0.1~
1.5毫摩尔每升,催化剂用量为1.00~5.02U/mL,甲醇体积浓度为5%。
7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液用1摩尔每升KH2PO4调节pH至7.5,即为粗酶液;
将粗酶液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行过滤,取纳滤膜过滤的滤液在pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜;透过液上经pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液平衡后的Bio-Rad HighS强阳离子交换柱,再用0.1摩尔每升KCl水溶液洗脱杂蛋白,最后用0.2摩尔每升KCl水溶液洗脱,流速均为1毫升每分钟,收集目的蛋白,在pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜,取透过液,获得脱酰基酶纯酶液,即为催化剂。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵液按如下方法制备:将含脱酰基酶突变体基因的工程菌接种到含终浓度25微克每毫升普那霉素的种子培养基中,28摄氏度、200转每分钟培养3天,作为一级种子培养液;以体积浓度10%的接种量接种到新鲜的种子培养基中,28摄氏度、200转每分钟培养2天,作为二级种子培养液;以体积浓度10%的接种量接种到新鲜的发酵培养基中,30摄氏度、200转每分钟培养2.5天,4摄氏度、8000转每分钟离心
10分钟,获得上清液;所述种子培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4·3H2O 1.5g/L,用H3PO4和KOH调节pH至7.0,溶剂为去离子水;所述发酵培养基组成:蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4·3H2O 1.5g/L,用H3PO4和KOH调节pH至7.0,溶剂为去离子水。