1.一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体,主要包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码MalE信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码连接肽GGSGGGSG的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、终止子。
2.如权利要求1所述的重组载体,其特征在于编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列如SEQ ID No.1所示,编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的重组载体,其特征在于编码MalE信号肽的核酸序列如SEQ ID No.5所示,编码连接肽GGSGGGSG核酸序列如SEQ ID No.6所示。
4.一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达基因工程菌,由权利要求1所述重组载体转化宿主菌所得。
5.如权利要求4所述的基因工程菌,其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求4所述基因工程菌在微生物催化制备阿尼芬净中间体——棘白菌素B母核化合物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在所述应用为:以棘白菌素B为反应底物,以所述基因工程菌的湿菌体或湿菌体经破碎获得的酶液为生物催化剂,以尿素、氯化胆碱为助溶剂,以pH 7~8磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系,在温度35~45℃、搅拌速度500~800r/min的条件下进行生物催化反应制得所述棘白菌素B母核化合物。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法获得:
将基因工程菌接入TB培养基中,35~37℃、150~200rpm培养至OD 600达到0.8,向发酵液中加入终浓度0.1~1mM的诱导剂IPTG,转到12~28℃、150~200rpm摇床中诱导产酶,将获得的发酵液,离心收集菌体沉淀,即得所述湿菌体。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于诱导剂IPTG添加浓度为0.2mM,添加诱导剂后转到16℃、180rpm摇床中诱导产酶16h,将获得的发酵液,离心收集菌体沉淀,即得所述湿菌体。