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专利号: 2018116504209
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:首先在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因,然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因,得到产β-胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。

2.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因的方法为:以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物gut2-up-F和gut2-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增gut2基因的上游同源臂,利用引物gut2-down-F和gut2-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增gut2基因的下游同源臂;将gut2基因的上游同源臂插入到质粒pUra3的ApaI/SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up;将gut2基因的下游同源臂插入到质粒pUra3-gut2-up的NdeI/SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up&down;将质粒pUra3-gut2-up&down用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组中,得到敲除gut2基因的解脂亚罗酵母,即菌株Po1f(△gut2);

上述的质粒pUra3的碱基序列如SEQ ID No.1所示;

上述各引物序列如下:

gut2-up-F:AGCTAGGGCCCGGGTTGGACAATATACAAATG

gut2-up-R:ATGCAGCATGCTTGTTTGGGGTGGTGGGT

gut2-down-F:ATGCGACTAGTCTGTATAGTAAAAGCGTATAGCCgut2-down-R:AGCGACATATGTCGTATAACTTGTAAGTATACAGTAACT。

3.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为:以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-erg13;

以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13基因插入到质粒pJN44-erg13的单酶切位点SpeI,得到质粒pJN44-erg13-erg13;

上述各引物序列如下:

erg13-assembly-smaI-F:CAGGTCGACTCTCCCATGTCGCAACCCCAGAACGerg13-assembly-smaI-R:ACTATCTGTTAACCCCTACTGCTTGATCTCGTACTTTCGTCG。

4.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为:以质粒pJN44-erg13-erg13为模板,利用引物erg13-assembly-EcorI-F和erg13-assembly-spHI-R,用高保真酶KD plus PCR扩增两个拷贝数的erg13基因,并将两个拷贝数的erg13基因插入到pUra3-gut2-up&down的双酶切位点EcoRI和spHI,得到质粒pUra3-erg13-erg13;将质粒pUra3-erg13-erg13用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵母转化试剂盒转入菌株Po1f(△gut2)的基因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到菌株YL2;

上述各引物序列如下:

erg13-assembly-spHI-F:CACCACCCCAAACAAGGAATTCGAGCTCGGTACCCGerg13-assembly-EcorI-R:GACCGCGATCGAATTTCAGGCGGCCGCGAATTC。

5.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因的方法为:以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物Hxk-assembly-smaI-F和Hxk-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增Hxk基因,将Hxk基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-Hxk;将质粒pJN44-Hxk用酵母转化试剂盒转入菌株YL2的基因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到产β-胡萝卜素的基因工程菌株;

上述各引物序列如下:

Hxk-assembly-smaI-F:CAGGTCGACTCTCCCATGGTTCATCTTGGTCCCCGAHxk-assembly-smaI-R:ACTATCTGTTAACCCCTAAATATCGTACTTGACACCGGGCT。

6.权利要求1的构建方法得到的产β-胡萝卜素的基因工程菌株。