1.一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌,其特征在于,所述工程菌为 Escherichia coli(DH5α-LNSF1),该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,其保藏编号为:GDMCC No.60445。
2. 根据权利要求1所述的工程菌,其特征在于,所述工程菌为:含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、Enterococcus faecium LNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCB-efagadB重组质粒。
3.一种构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1. 克隆 Enterococcus faecium LNSF2的GAD基因gadB;
S2. 构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3和T7终止子序列的大肠杆菌pRPOCB表达载体;
S3. 采用屎肠球菌gadB基因与pRPOCB表达载体构建重组质粒pRPOCB-efagadB;
S4. 将重组质粒pRPOCB-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞,构建表达CBM-GAD融合酶的工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF1);
其中,CBM为纤维素结合模块,GAD为谷氨酸脱羧酶。
4. 权利要求1或2所述基因工程菌Escherichia coli(DH5α-LNSF1)在高效固定化屎肠球菌GAD或制备屎肠球菌GAD固定化酶中的应用。
5.一种使用权利要求1或2所述基因工程菌高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:S11. 在冰水浴的条件下,于缓冲液中破碎 Escherichia coli(DH5α-LNSF1)菌体,提取CBM-GAD融合酶粗酶液;
S12. 将CBM-GAD融合酶粗酶液与改性甲壳素混合并搅拌,发生亲和吸附形成甲壳素-CBM-GAD,滤除液体,分离到的固形物即为屎肠球菌GAD固定化酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性或经NaOH/尿素混合溶液改性的甲壳素。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S12所述改性甲壳素为经浓磷酸改性的甲壳素。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述经浓磷酸改性的甲壳素的制备方法为:在冰浴下,用浓磷酸溶解甲壳素至混合物变透明,再用冰水稀释使甲壳素充分沉淀,收集甲壳素沉淀,然后用蒸馏水或结合Na2CO3溶液将甲壳素沉淀洗涤至中性,即可得到浓磷酸改性的甲壳素。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S11所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
10. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S11所述缓冲液的浓度为10~100 mmol/L。