1.克隆目的基因片段的方法，其包括以下步骤：

1）从染色体或载体获得目的基因片段；

2）在酵母细胞内将目的基因片段重组到含有筛选标记的穿梭载体中，步骤2）中的穿梭载体为pTARYAC‑TRP1；3）将步骤2）的穿梭载体转入细菌细胞中，使所述穿梭载体在所述细菌细胞中扩增；

4）用限制性内切酶消化所述穿梭载体，以获得DNA片段，其中所述限制性内切酶是归位内切酶；

其中所述步骤4）中获得的DNA片段为100kb至300kb的DNA片段，并且所述DNA片段具有

60‑‑800bp的同源末端；

5）将步骤4）获得的多个有同源末端的DNA片段和线性化载体一起转化到有同源重组活性的酵母中，从而在细胞内组装成获得包含多个目的基因片段的按照一定顺序排列的重组子，其中所述线性化载体包含与步骤2‑4中的穿梭载体中的筛选标记不同的筛选标记，步骤

5）中的线性化载体为pTARYAC‑HIS5。

2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤1）包括利用基因组编辑技术对所述染色体或载体进行切割以获得所述目的基因片段。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述步骤2）包括利用同源重组拼接技术将所述目的基因片段克隆到所述穿梭载体中。

4.根据权利要求1 3中任一项的方法，其中所述步骤4）中获得的DNA片段具有90‑200bp~的同源末端。

5.根据权利要求1 4中任一项的方法，其中，从BAC载体获得目的基因片段。

~

6.根据权利要求2‑5中任一项的方法，其中所述基因组编辑技术选自以下的一种或者多种：锌指核酸酶技术，类转录激活因子效应物核酸酶技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列技术，包括CRISPR/Cas9和CRISPR‑Cpf1。

7.根据权利要求6的方法，其中所述基因组编辑技术为CRISPR/Cas9。

8.根据权利要求3‑7中任一项的方法，其中所述同源重组拼接技术选自以下的一种或者多种：序列依赖的体外装配技术，酵母的转化耦联重组技术和细菌的Red/ET同源重组技术。

9.根据权利要求8的方法，其中所述同源重组拼接技术为酵母的转化耦联重组技术。

10. 根据权利要求1 9中任一项的方法，其中所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces ~cerevisiae）。

11.根据权利要求1 10中任一项的方法，其中所述用于扩增的细菌是大肠杆菌。

~

TM TM

12.根据权利要求11的方法，其中用于扩增的细菌是ElectroMAX DH5α‑E Competent细胞。

13.根据权利要求1 12中任一项的方法，其中所述目的基因片段，包括原核和真核基因~片段。

14.根据权利要求13的方法，其中所述目的基因片段为真核基因片段，其长度超过

100kb。

15.根据权利要求14的方法，所述目的基因片段的长度超过300kb。

16.根据权利要求15的方法，所述目的基因片段的长度超过400kb。

17.根据权利要求1 16中任一项的方法，其中所述限制性内切酶是ICeuI、I‑SceI、PI‑~PspI、PI‑SceI。

18.根据权利要求1 17中任一项的方法，其还包括利用URA3抗性筛选系统筛选所述步~骤5)获得的包含目的基因片段的重组子，所述筛选包括：

1）将所述目的基因片段整合到YAC载体中的ADH1启动子和URA3之间；

2）在含有5‑FOA和相应营养缺陷型选择培养基，例如TRP1营养缺陷型选择培养基上筛选转化了包含所述目的基因片段的重组子的酵母细胞。

19.根据权利要求1 18中任一项的方法，其中在所述步骤4）和5）之间还包括以下步骤：~

重复步骤1）‑4）以制备一系列的DNA片段，所述DNA片段具有同源末端。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述DNA片段具有90‑200b的同源末端。

21.根据权利要求1 20中任一项的方法，其中所述细胞是有DNA同源重组活性的细胞。

~

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述细胞为酵母细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

24.根据权利要求1 23中任一项的方法，还包括在步骤5）后再进行一次或多次步骤4），~获得多个具有同源末端的DNA片段，将其再进行步骤5）而获得按照一定顺序排列的300kb以上的重组子。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，获得的多个具有同源末端的DNA片段在100kb以上。