1.一种提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:该方法将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上ERG4/ERG24还原酶基因失活,使该基因在红曲霉菌中缺失而不能正常表达。
2.根据权利要求1所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述的红曲霉菌为紫色红曲霉菌,所述编码甾醇还原酶ERG4/ERG24基因为Monascus_07017;所述编码甾醇还原酶ERG4/ERG24基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述将紫色红曲霉菌中编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除,是利用农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶ERG4/ERG24基因。
4.根据权利要求3所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述通过农杆菌介导转化法基因敲除技术使编码ERG4/ERG24还原酶基因缺失,包括如下步骤:
1)利用软件分析SEQ ID No:1所示的序列;
2)以紫色红曲霉菌的cDNA为模板,以7017-up-osc-F和7017-up-osc-R为第一对引物以及7017-dn-osc-F和7017-dn-osc-R为第二对引物分别进行PCR扩增得到Monascus_07017基因的5’和3’同源臂片段;所述7017-up-osc-F的序列为SEQ ID No:2;所述7017-up-osc-R的序列为SEQ ID No:3;所述7017-dn-osc-F的序列为SEQ ID No:4;所述7017-dn-osc-R的序列为SEQ ID No:5;
3)以质粒pXS为模板,以G418-osc-F和G418-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到G418基因片段;所述G418-osc-F的序列为SEQ ID No:6;所述G418-osc-R的序列为SEQ ID No:7;所述质粒pXS的序列为SEQ ID No:12;
4)采用Overlap PCR技术,以Monascus_07017基因的5’、3’同源臂片段以及G418基因片段为模板,以7017-up-osc-F和7017-dn-osc-R为一对引物进行PCR扩增得到△7017目的片段;
5)用EcoR I和SaI I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300,利用一步克隆技术连接线性化双元载体pCAMBIA1300与△7017目的片段,即得到双元敲除质粒pCAMBIA1300-△7017;
6)根癌农杆菌EHA105介导双元敲除质粒pCAMBIA1300-△7017,转化至紫色红曲霉菌中,筛选阳性克隆,即得到所述红曲胞外色素高产菌株。
5.根据权利要求4所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述步骤6)具体包括以下操作:先制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞,再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105,随后将含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的农杆菌转化至紫色红曲霉菌株中,再筛选阳性克隆,即得到所述红曲胞外色素高产菌株。
6.根据权利要求5所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞的具体制备方法是:将根癌农杆菌EHA105接种于5~10mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中,以温度28℃、转速200rpm的条件培养约24~48h至对数生长期;
取500μL活化的菌液接种于20mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中,以温度28℃、转速
200rpm的条件培养至菌液OD600=0.5;将菌液冰浴30min后,在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min,弃上清,收集菌体;用50mmol/L CaCl2洗涤菌体两次,再重悬于2mL 50mmol/L CaCl2中,得到根癌农杆菌EHA105感受态细胞。
7.根据权利要求5所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017导入根癌农杆菌EHA105的具体实现方式是:取2μg所述双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017加入到200μL的根癌农杆菌EHA105感受态细胞中,混匀后冰浴30min;液氮中速冻1min,后用37℃金属浴保温3min;加入800μL的YEB液体培养基,28℃培养3h;室温下以5000rpm的转速离心5min,浓缩菌体;取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB选择性培养基平板上,28℃倒置培养
48h;挑选转化子于YEB液体培养基中培养,并用引物对克隆子进行筛选,得到阳性克隆子,即为含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105。
8.根据权利要求5所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述含有双元表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105转化至紫色红曲霉菌中的具体实现方式是:将红曲菌接种到PDA斜培养基,30℃培养7d,用无菌水从斜面上洗下红曲菌孢子,通过两层无菌擦镜纸过滤,调节孢子浓度;取含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105,接种于3mL含50μg/mL利福平,50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中,28℃,220rpm12~24h,取250μL的菌液于50mLMM培养基中,在相同条件下培养2d,测培养基中农杆菌的值,并用IM培养基稀释菌液至OD600值为0.15;再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用;将以上所得的紫色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pCAMBIA1300-△7017的根癌农杆菌EHA105菌液,混合涂布于铺有玻璃纸的含200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM诱导培养基平板上,25℃共培养。
9.根据权利要求8所述的提高红曲胞外色素的方法,其特征在于:所述筛选阳性克隆的具体实现方式是:
共培养4d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中,然后倒入约含有50μg/mL G418和
500μg/mL头孢霉素的PDA培养基,25℃培养,从第2天开始观察,将长出的菌落挑至含50μg/mL G418的PDA培养基上,30℃培养7d;如果在培养基上仍然能生长,即推定为转化子,并将之接种到PDB液体培养基中培养,按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析,以提取基因组为模板,用两对引物7017-T-F和7017-T-R、G418-T-F和7017-half-R进行PCR验证,选取阳性菌株;所述7017-T-F的序列为SEQ ID No:8;所述7017-T-R的序列为SEQ ID No:9;所述G418-T-F的序列为SEQ ID No:10;所述7017-half-R的序列为SEQ ID No:11。
10.一种基于如权利要求4或5或6或7或8或9所述的提高红曲胞外色素的方法构建得到的高产红曲胞外色素的重组菌株;所述重组菌株的胞外红曲色素达6.52U/mL。