1.一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)称取牛毛作为样品,用去离子水反复搓洗,去除表面杂质,烘干;
2)将烘干的样品在50-60℃下,以1:95-105的浴比加入至0.06-0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中,用醋酸调节pH至6-6.5,煮25-35min,洗除油脂、杂质,重复一次;
3)洗除油脂之后,将样品用去离子水冲洗干净,在40-50℃下干燥,得到烘干的牛毛;
4)将步骤3)烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别,其中A1组作为对照组,不做任何处理;将A2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-
35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
5)将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留B1组残余牛毛;将B2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
6)将步骤5)酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留C1组残余牛毛;将C2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
7)将步骤6)酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留D1组残余牛毛;将D2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
8)将步骤7)酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理;
9)将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留F1组残余牛毛;将F2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-
0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
10)将步骤9)酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留G组残余牛毛;
11)将步骤10)酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理;
12)将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留I1组残余牛毛;将I2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-
6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:
19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
13)将步骤12)酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留J1组残余牛毛;将J2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
14)将步骤13)酶解过的K组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理;
15)对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组酶解后的残余牛毛进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛;
16)利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析,对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K,分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布;
17)在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下,对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2,分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
2.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)和步骤13)中,酶解反应具体为:将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组和将步骤12)酶解过的J1、J2组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的木瓜蛋白酶溶液中,控制反应温度
50-60℃,溶液pH=5-6,反应6-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留B1、J1组残余牛毛。
3.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤6)和步骤9)中,酶解反应具体为:将步骤5)酶解过的C1、C2、D1、D2、E组,以及F1、F2、G、H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的糜蛋白酶溶液中,控制反应温度35-40℃,溶液pH=5.5-6.5,反应6-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留C1、 F1组残余牛毛。
4.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤7)、步骤11)和步骤12)中,酶解反应具体为:将步骤6)酶解过的D1、D2、E组、步骤10)酶解过的H组和I1、I2、J1、J2、K组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的菠萝蛋白酶溶液中,控制反应温度50-60℃,溶液pH=5-6.5,反应6-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留D1、H、I1组残余牛毛。
5.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤8)、步骤10)和步骤14)中,酶解反应具体为:将步骤7)酶解过的E组、步骤9)酶解过的G、H组和步骤13)酶解过的H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的弹性蛋白酶溶液中,控制反应温度20-30℃,溶液pH=7.5-8,反应6-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留G组残余牛毛。
6.如权利要求1-5之一所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)至步骤14)中,酶溶液为现配现用;同时用0.2-0.4wt%的苹果酸和0.1-
0.15w% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。
7.如权利要求1-5之一所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)至步骤14)中,灭酶处理为:在90-100℃的烘箱中保温1-2h,使酶失活。
8.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤4)至步骤7)、步骤9)、步骤12)、步骤13)中,通氮气搅拌具体为向三口烧瓶中持续通入氮气,利用机械搅拌以180-220r/min的速度搅拌。
9.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤4)至步骤7)、步骤9)、步骤12)、步骤13)中,调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦pH=4-6。