1.一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)称取羊毛作为样品,用去离子水反复搓洗,去除表面杂质,烘干;
2)将烘干的样品在50-60℃下,以1:95-105的浴比在含有0.06-0.08wt%十二烷醇聚氧乙烯醚和0.2-0.4wt%硫酸钠的混合溶液中煮25-35min,洗除油脂、杂质,重复一次;
3)洗除油脂之后,将样品用去离子水冲洗干净,在40-50℃干燥,得到烘干的羊毛;
4)将步骤3)烘干的羊毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D、E、F1、F2、G、H等质量份的12组,其中A1组作为对照组,不做任何处理;将A2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:18-20的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
5)将B1、B2、C1、C2、D、E组浸入到胃蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留B1组残余羊毛;将B2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:
18-20的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
6)将步骤5)酶解过的C1、C2、D、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留C1组残余羊毛;将C2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:18-20的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
7)将步骤6)酶解过的D、E组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留D组残余羊毛;
8)将步骤7)酶解过的E组浸入到葡萄球菌蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理;
9)将F1、F2、G、H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留F1组残余羊毛;将F2放入三口烧瓶中,在45-55℃下,以1:18-22的浴比在pH=4-6的
0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中,通氮气搅拌反应25-35min,然后在40-50℃下,以1:18-
20的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min;
10)将步骤9)酶解过的G、H组浸入到葡萄球菌蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留G组残余羊毛;
11)将步骤10)酶解过的H组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理;
12)对A2、B1、B2、C1、C2、D、E、F1、F2、G、H组酶解后所得残余羊毛进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余羊毛;
13)利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余羊毛进行氨基酸分析,对比A1、B1、C1、D、E、F1、G、H,分析羊毛角蛋白中氨基酸的径向分布;
14)在分析出羊毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下,对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、F1和F2,分析羊毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
2.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)中,酶解反应具体为:将B1、B2、C1、C2、D、E组以1:38-42的浴比放入预先配制好的
1-2g/L的胃蛋白酶溶液中,控制反应温度35-40℃,溶液pH= 3-4,反应5-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留B1组残余羊毛。
3.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤6)和步骤9)中,酶解反应具体为:将步骤5)酶解过的C1、C2、D、E组,以及F1、F2、G、H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的菠萝蛋白酶溶液中,控制反应温度50-60℃,溶液pH= 5-6.5,反应5-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留C1、 F1组残余羊毛。
4.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤7)和步骤11)中,酶解反应具体为:将步骤6)酶解过的D、E组和步骤10)酶解过的H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的胰蛋白酶溶液中,控制反应温度35-40℃,溶液pH=7.4-8.2,反应5-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留D、H组残余羊毛。
5.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤8)和步骤10)中,酶解反应具体为:将步骤7)酶解过的E组和步骤9)酶解过的G、H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的葡萄球菌蛋白酶溶液中,控制反应温度35-40℃,溶液pH=7.5-8,反应5-7h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留G组残余羊毛。
6.如权利要求1-5之一所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)至步骤11)中,酶溶液为现配现用;同时用0.2-0.4wt%的酒石酸和0.1-
0.15wt% 酒石酸钠溶液调节溶液pH。
7.如权利要求1-5之一所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤5)至步骤11)中,灭酶处理为:在90-100℃的烘箱中保温1-2h,使酶失活。
8.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤4)至步骤6)、步骤9)中,通氮气搅拌具体为向三口烧瓶中持续通入氮气,利用机械搅拌以180-220r/min的速度搅拌。
9.如权利要求1所述的一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法,其特征在于,步骤4)至步骤6)、步骤9)中,调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用酒石酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦pH=4-6。