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专利号: 2018109500557
申请人: 江苏海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种用于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)特异性识别的ssDNA核酸适配体,其特征在于:所述核酸适配体的核苷酸序列为Apt-Vv01所示的DNA片段的核苷酸序列:Apt-Vv01:

5’- ctgcagaattctaatacgagtcactataggaagatggcgaaacatcttttctgatgagagttgcgacctcccggatgagtgccctggctccgggtttgtctatttttgggggtgttgacagatatccttagtgacggtaagcttggcac-3’。

2.一种如权利要求1所述的用于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)特异性识别的ssDNA核酸适配体的筛选方法,其特征在于,具体步骤如下:(1)合成含有80个随机碱基的初始寡核苷酸文库;

(2)将要检测的创伤弧菌(Vibrio vulnificus)在LB培养基中进行培养;

(3)将上述菌液进行梯度稀释并涂布培养基检测菌液浓度;

(4)将步骤(2)所得菌体离心,保留沉淀;

(5)将步骤(4)所得沉淀用结合缓冲液进行洗涤并保留沉淀;

(6)将结合缓冲液稀释的600pM步骤(1)所得随机文库进行变性;

(7)将步骤(5)所得沉淀和步骤(6)所得变性文库混匀,结合1小时;

(8)结合完毕后离心并弃去上清,沉淀用洗涤缓冲液清洗三次;

(9)去离子水重悬沉淀,加热变性获取上清并检测浓度;

(10)不对称PCR扩增,产物用于下一轮筛选;

(11)测序分析,合成FAM荧光素标记的核酸适配体。

3.根据权利要求2所述的用于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)特异性识别的ssDNA核酸适配体的筛选方法,其特征在于,步骤(3)中:初始创伤弧菌菌体浓度为2×108 CFU每毫升。

4.根据权利要求2所述的用于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)特异性识别的ssDNA核酸适配体的筛选方法,其特征在于:所有结合反应均在1.5毫升无菌离心管中进行。

5.根据权利要求2所述的用于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)特异性识别的ssDNA核酸适配体的筛选方法,其特征在于,步骤(11)中:适配体浓度测定中使用的仪器为超微量紫外分光光度计;适配体结合荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪;适配体结合荧光成像实验的仪器为奥林巴斯倒置显微镜。

6.一种如权利要求1中所述的核酸适配体或者权利要求2-5中任何一项所筛选得到的核酸适配体的应用,其特征在于,所述的应用为在非治疗目的的诊断、食品加工、水产养殖监控、环境检测方面对创伤弧菌的检测应用。

7.根据权利要求6中所述的应用,其特征在于:检测创伤弧菌的最低检测菌浓度为

8CFU/mL, 检测浓度范围为8CFU/mL至2×108 CFU/mL。