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专利号: 2018108395727
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于所述酶按如下方法制备:(1)氧化聚蔗糖:将聚蔗糖溶于0.25M NaIO4水溶液中,37℃、150rpm避光反应6h,加入乙二醇终止反应,将反应液在蒸馏水中透析,将透析后的截留液冻干,获得氧化聚蔗糖;所述NaIO4水溶液体积用量以聚蔗糖质量计为5-50mL/g;(2)将氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶溶于0.2M、pH8.0磷酸盐缓冲液中,混匀后于0-15℃、600rpm反应3-30h,用蒸馏水透析,取截留液用体积浓度50%乙醇水溶液沉淀,取沉淀,获得聚蔗糖修饰的环氧化物水解酶;所述氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶质量比为0.5-500:1。

2.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于步骤(1)所述聚蔗糖的分子量为70-700kDa。

3.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于步骤(1)所述透析时间为24h,间隔12h更换一次透析液,所述透析袋截留分子量为14000Da。

4.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于步骤(2)所述环氧化物水解酶酶活为10~1000U/mg。

5.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于步骤(2)所述环氧化物水解酶是由含环氧化物水解酶基因的菌株经发酵培养获得的湿菌体分离提取的纯酶;所述菌株包括黑曲霉(Aspergillus niger)、放射性土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacter)或粘红酵母菌(Rhodotorula glutinis)。

6.如权利要求5所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于步骤(2)所述磷酸盐缓冲液体积用量以环氧化物水解酶质量计为0.1-10mL/mg。

8.如权利要求5所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶,其特征在于所述环氧化物水解酶按如下方法制备:

(1)湿菌体:

将含环氧化物水解酶基因的菌株接种至斜面培养基,在37℃培养12h,获得斜面菌体;

所述斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;

将斜面菌体接种至种子培养基,在37℃培养10h,获得种子液;所述种子培养基终浓度组成为蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;

将种子液以体积浓度2%的接种量接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的发酵培养基中,在37℃恒温培养至OD600等于0.6-0.8后,加入终浓度0.1mM的IPTG,在28℃下培养12h,发酵液离心,收集湿菌体;发酵培养基终浓度组成:蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母提取物5g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;

(2)环氧化物水解酶的分离纯化

取步骤(1)制备的湿菌体于pH 8.0、200mM PBS缓冲液中悬浮,震荡摇匀后在超声波功率为300W下破碎,超声频率1s间歇1s,破碎时间为20min,破碎液于10000r/min,4℃条件下离心10min去除细胞碎片,所得上清液即为粗酶液;将粗酶液用Ni-NTA进行纯化,先用上样缓冲液平衡Ni-NTA柱30min,接着上样粗酶液,然后用上样缓冲液以1mL/min的速度洗脱以除去未吸附的蛋白,最后用洗脱缓冲液以1mL/min的速度洗脱,收集目标蛋白;将目标蛋白在20mM,pH 8.0,0℃的PBS缓冲液中透析过夜,取截留液冻干,获得纯化的环氧化物水解酶;

所述上样缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM PBS缓冲液,pH 8.0;所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM PBS缓冲液,pH 8.0。

9.一种权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶在拆分环氧氯丙烷中的应用。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于所述应用方法为:以pH8.0、0.2M的PBS缓冲液为反应介质,以氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶为催化剂、以外消旋环氧氯丙烷为底物构成反应体系,在温度35℃、转数100rpm下进行反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得R-环氧氯丙烷;所述反应体系中,底物终浓度800mM,催化剂用量为100~1000U/ml。