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专利号: 2018107028576
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸合成菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法按如下步骤进行:将待测菌株在含有底物R-2-苯氧基丙酸的发酵培养基中培养,获得的发酵液离心,取上清液作为待测样品;将待测样品与显色剂混合,在40-60℃的条件下反应5-

70min,取反应液测420nm处吸光值,根据R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量,筛选获得R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸合成菌株;所述显色剂是将亚硝酸钠溶于去离子水配制成浓度1-9g/L,用硫酸调节pH为1.4-6.0;所述R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线是用R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液替代待测样品,在相同条件下测420nm处吸光值,以R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标,420nm处吸光值为纵坐标制成。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述显色剂亚硝酸钠浓度为6.0g/L、pH为1.4。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于反应条件为60℃静置反应30min。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述待测样品与显色剂体积比为1:1。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述底物在发酵培养基中的浓度为10.0g/L。

6.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述待测菌株发酵方法条件为:28℃,150r/min发酵培养7d,获得发酵液。

7.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线如下方法制备:用去离子水分别配制0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、

0.8g/L、0.9g/L和1.0g/L浓度梯度的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准溶液,分别取不同浓度的标准溶液于96孔微孔板的微孔,每个微孔中加入显色剂,在60℃条件下反应30min,测定

420nm处吸光值,以R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线;所述微孔中,显色剂与标准溶液体积比为1:1,所述显色剂是将亚硝酸钠溶于去离子水配制成浓度6.0g/L,用硫酸调节pH为1.4。

8.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述筛选方法按如下步骤进行:取采样点的泥土,用生理盐水制成悬浊液,静置沉降;取上清液涂布于PDA培养基平板中,用封口膜将平板封住,于28℃培养至长出菌落;用接种环挑平板中单菌落接种于第一富集培养基中,28℃、

150r/min下进行第一次富集培养2-3d;以体积浓度2%的接种量将第一次富集培养的菌液接种于第二富集培养基中,28℃,150r/min下进行第二次富集培养1-2d;将第二次富集培养的菌液稀释后涂布于含10.0g/L R-2-苯氧基丙酸的PDA平板上,并在28℃恒温静置培养3-

4d;将平板上的单菌落作为待测菌株逐一接种至种子培养基,28℃培养72h;然后转接至含

10.0g/L R-2-苯氧基丙酸的发酵培养基,28℃、150r/min培养7d,获得发酵液;将发酵液离心,取上清液作为待测样品;将待测样品与显色剂以体积比1:1混合,在60℃的条件下反应

30min,取反应液检测420nm处吸光值,根据R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量,筛选获得高产R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的菌株。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于所述发酵培养基组成为:葡萄糖5.0g/L、酵母提取物5.0g/L、硫酸铵5.0g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、磷酸二氢钾

1.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6g/L、硫酸亚铁七水合物2mg/L、硫酸锌四水合物100μg/L、硼酸300μg/L、氯化钴六水合物200μg/L、氯化铜二水合物10μg/L、氯化镍六水合物20μg/L、钼酸钠二水合物30μg/L,用2M的氢氧化钠调节pH为6.8,溶剂为去离子水;所述种子培养基、第一富集培养基和第二富集培养基组成均同发酵培养基组成。