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专利号: 2018104682332
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.Ogura CMS不育恢复基因RfoB,其核苷酸序列是根据来自萝卜(Raphanus sativus)Ogura CMS细胞质不育Rfo恢复位点的Rfo基因编码区cDNA序列,结合结球甘蓝(Brassica oleracea var capita)密码子偏好性进行密码子优化而成,所述萝卜Ogura CMS细胞质不育Rfo基因编码区cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的Ogura CMS不育恢复基因RfoB,其特征在于,所述Ogura CMS不育恢复基因RfoB的ORF(开放性阅读框)具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的Ogura CMS不育恢复基因RfoB,其特征在于,所述恢复基因RfoB自上游密码子(ATG)起第103位处插入有来自马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的一段内含子序列,所述ST-LS1基因的一段内含子序列如SEQ ID No.3所示,所述恢复基因RfoB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.权利要求1-3任一项所述的Ogura CMS不育恢复基因RfoB在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。

5.表达如权利要求1-3任一项所述的Ogura CMS不育恢复基因RfoB的植物表达载体,所述植物表达载体含有RfoB表达元件,RfoB表达元件中的启动子是PRfo,PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.如权利要求5所述的植物表达载体,其特征在于,所述RfoB表达元件中的终止子为E9-t,E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

7.如权利要求6所述的植物表达载体,其特征在于,所述RfoB表达元件的下游插入有筛选标记基因表达元件,所述筛选标记基因是BAR基因(除草剂草丁膦抗性基因)、NPTII(卡拉霉素抗性基因)或hpt(潮霉素抗性基因)。优选的,所述筛选标记基因是BAR基因。

8.如权利要求7所述的植物表达载体,其特征在于,所述筛选标记基因表达元件中的启动子为CaMV35S。

9.权利要求5-8任一项所述的植物表达载体在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。

10.权利要求1-3任一项所述的Ogura CMS不育恢复基因RfoB在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用方法:包括以下步骤:(1)人工合成恢复基因RfoB序列,并将RfoB序列克隆于PUC57(GenBank:Y14837.1)质粒上;

(2)提取甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系ougRR-271基因组DNA,采用引物对pRfo-F和pRfo-R,以ougRR-271基因组DNA进行PCR扩增,获得启动子PRfo片段,将获得PRfo的克隆于PBluescripte SK质粒的EcoRV位点进行测序,PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,pRfo-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,pRfo-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;

(3)提取豌豆基因组DNA,采用引物对E9-F和E9-R,以豌豆基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得终止子E9-t,将获得的E9-t克隆于PBluescripte SK质粒的EcoRV位点进行测序,E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6,E9-F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,E9-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示;

(4)以植物表达载体pCA1300BAR为基础进行改建,改建包括以下步骤:

步骤①,将克隆验证的E9-t终止子序列从PBluescripte SK质粒上用EcoRI+BamHI双酶切下后替换pCA1300BAR中的Nos终止子;

步骤②:将合成的RfoB基因用NcoI+BamHI切下插入步骤①获得的载体的NcoI和BamHI位点之间;

步骤③:将克隆到的PRfo启动子用HindIII+NcoI切下替换步骤②获得的载体中的双

35S启动子,获得最终的植物表达载体PRfo::RfoB-E9t;

(5)构建的植物表达载体PRfo::RfoB-E9t转化农杆菌EHA105,将含PRfo::RfoB-E9t农杆菌转染化芸薹属Ogura CMS细胞质不育系的外植体,转化后的外植体经筛选培养获得转基因植株,即为薹属Ogura CMS细胞质雄性恢复系;

所述植物表达载体pCA1300BAR的核苷酸序列为SEQ ID No.11,所述植物表达载体PRfo::RfoB-E9t中的RfoB基因表达盒如SEQ ID No.12所示。