1.一株产抗厌氧菌化合物的菌株,其为曲霉属,保藏编号为CCTCC NO.M 2017715,分类命名为Aspergillus ustus A2。
2.根据权利要求1所述的一种产抗厌氧菌化合物的真菌菌株,其特征是:该菌株从榆树的叶分离培养而得,该菌株生产的抗厌氧菌化合物包括4个结构新型的补身烷类倍半萜化合物ustusol H1(焦曲霉素H1),ustusol H2(焦曲霉素H2),ustusol H3(焦曲霉素H3),ustusol H4(焦曲霉素H4)和已知化合物TMC-120C(2-(7-甲基-2,3-二氢呋喃[3,2-h]异喹啉-2-yl)丙醇-2-醇);
3.一种产抗厌氧菌化合物的真菌菌株的发酵方法和产物富集方法,其特征是,所述方法包括以下步骤:(a)真菌Aspergillus ustus A2在25℃,麦芽固体培养基活化培养7d后,取0.5cm2菌块接种到400mL麦芽液体培养基,在24℃恒温振荡箱中培养5d,得到该真菌液体种子液;
(b)将上述真菌液体种子液按8%接种量,接种到50g固体生产培养基,放置22℃恒温培养箱中培养25d,结束发酵,得到含有抗厌氧菌化合物的发酵产物。
4.根据权利要求3所述的产抗厌氧菌化合物的真菌菌株的发酵方法和产物富集方法,其特征是,上述步骤(a)中,所述麦芽固体培养基的组成为:生麦芽20g、蛋白胨2g、羧甲基纤维素钠1g,K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g、酵母膏1g,琼脂粉20g,加水溶解至1000ml、分装、灭菌后备用;不加琼脂,其余组成与上述的麦芽固体培养基相同,以形成所述的麦芽液体培养基。
5.根据权利要求3所述的产抗厌氧菌化合物的真菌菌株的发酵方法和产物富集方法,其特征是,上述步骤(b)中,所述固体生产培养基的制备步骤为:生麦芽20g、大米20g、麸皮
10g,玉米芯10g,维生素C 0.5g,混合均匀后,加入72毫升水浸泡4h,灭菌后为固体生产培养基。
6.一类抗厌氧菌化合物提取及制备方法,其特征是,所述方法包括以下步骤:
(a)将权利要求3中发酵产物按照1:8的质量:体积比加入甲醇,25℃超声震荡30min,抽滤得到提取液;上述提取液中加入石油醚以体积比1:1进行萃取,取甲醇部分在40℃下抽真空旋转蒸发得到含抗厌氧菌化合物的浸膏;
(b)将上述浸膏通过流动相,流动相为甲醇:水且含0.1%HF,在反向色谱柱上进行梯度洗脱;收集甲醇:水(含0.1%HF)60-65%段,旋转蒸发仪蒸干,通过HPLC制备得到ustusol H1,ustusolH2,ustusolH3和ustusol H4;收集甲醇:水(含0.1%HF)70%段,旋转蒸发仪蒸干,通过HPLC制备得到TMC-120C。
7.根据权利要求6中所述的一类抗厌氧菌化合物提取及制备方法,其特征是,上述步骤(b)中,所述ustusol H1,ustusolH2,ustusolH3和ustusol H4 HPLC制备条件是:色谱柱Allsphere ODS-2.5μm、250×4.6mm,柱温30℃,流动相甲醇:水60%,出峰时间分别为
16.2min,18.2min,21.05min和25.5min。
8.根据权利要求6中所述的一类抗厌氧菌化合物提取及制备方法,其特征是,上述步骤(b)中,所述TMC-120C HPLC制备条件是:色谱柱Allsphere ODS-2.5μm、250×4.6mm,柱温30℃,流动相甲醇:水65%,出峰时间为7.5min。
9.一类抗厌氧菌化合物的使用方法,其特征是,所述方法包括以下步骤:
(1)抗厌氧菌化合物准备
将化合物ustusol H1,ustusolH2,ustusolH3、ustusol H4和TMC-120C用无菌水分别制成浓度128μg/mL母液;用MH肉汤培养基稀释到试验所需浓度;
(2)测试菌种制备
将双岐杆菌、乳酸杆菌、韦荣球菌、厌氧链球菌、伊氏放线菌、厌氧链球菌、普通拟杆菌、消化链球菌分别从平板上挑菌落至MH肉汤培养基培养一定时间至混浊度达到0.5Mc加样接种;37℃培养16-24h,MTT法测定抗菌活性。
10.根据权利要求9所述的一类抗厌氧菌化合物的使用方法,其特征是,上述步骤(a)和(b)中MH肉汤培养基的组成:牛肉浸膏2g,可溶性淀粉1.5g,酸水解酪蛋白17.5g,pH值7.4±
0.2,加水溶解至1000ml、分装、灭菌后备用。