1.一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)双髻鲨鱼肉的预处理:取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆,加热至90~
95℃后保温5 10min,然后按照料液比1g:2 4mL加入异丙醇,于25~30℃、功率450~500W超~ ~
声提取2~3h,然后于4℃、9000 10000rpm离心10 15min除去异丙醇,收集脱脂双髻鲨鱼肉~ ~
固形物;2)脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解:取脱脂双髻鲨鱼肉固形物,按固液1g:10mL~
15mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液,用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节pH到9.0~
10.0,得混合液;将混合物温度调制55~65℃,按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%~
1.5%加入碱性蛋白酶,酶解时间2h~2.5h后,酶解液于90~95℃保温10~15min,灭酶活;将酶解液温度调至35 45℃,按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%~1.2%加入胰蛋白酶,酶~解时间3h~4h,酶解液于90~95℃保温10~15min后降至室温,于10000~12000rpm离心10~15min,取上清液;3)双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备:将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,得双髻鲨鱼肉抗氧化肽;其中,所述步骤2)中的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液浓度为0.05mol/L,pH值为9.5;碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×105U/g;胰蛋白酶的酶活力≥2.5×104U/g;所述步骤3)的超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为:超滤:将上述酶解上清液采用1kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于1kDa部分,得超滤酶解液;大孔树脂精制:将超滤酶解液配成15~20mg/mL的溶液,缓慢加入到超滤酶解液与D101大孔树脂比为1:10~15的玻璃柱中,用3~5倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质,再用3~4倍柱体积的95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱物,喷雾干燥,即为大孔树脂精制多肽;凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20~30mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,流速为0.8~1.2mL/min,洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测,按峰合并试管内溶液,比较各峰的羟基自由基的清除活性,选择活性最强组分冻干,即为凝胶层析酶解物;反相高效液相色谱纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100μg/mL的溶液,利用反相高效液相色谱进行纯化,所述反相高效液相色谱条件为:进样量15~20μL;色谱柱规格为250mm×4.6mm,填料直径为5μm的Zorbax SB-C18;流动相为水-乙腈梯度洗脱,0~45min乙腈浓度,由0匀速升至45%;洗脱速度0.8 1.0mL/min;紫外检测波长220nm,根据对羟基自~由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro,ESI-MS测定分子量为
610.77Da。