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专利号: 2015107166731
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2024-09-12
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种短小芽孢杆菌CotA漆酶的突变体,其特征在于,是以野生型短小芽孢杆菌CotA漆酶基因为模板将其第386位的Leu突变为Trp;所述短小芽孢杆菌CotA漆酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中GenBank登录号为KF040050的B.pumilus CotA漆酶氨基酸序列一致。

2.权利要求1所述的突变体的制备方法,包括如下步骤:

(1)以前期构建的质粒pColdII-CotA为模板,采用滚环PCR的方法,设计引物时在重叠区域引入突变位点,利用PCR扩增质粒pColdII-CotA得到含有编码CotA漆酶突变体的基因序列的开环重组载体;

(2)在PCR产物中加DMT酶消化PCR产物,然后进行1%琼脂糖凝胶电泳回收片段;

(3)利用特殊的重组酶和同源重组原理,将开环重组载体无缝拼接,形成环状结构;

(4)将环状质粒转化到DMT感受态细胞中,平板培养挑取单菌落测序,为的是提取到正确突变质粒;

(5)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和HisTrap HP 1mL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜,后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600≈0.5,迅速降温至15℃静置至少30min,加入最终浓度0.3mM的诱导剂IPTG诱导,24h时离心获得沉淀,用缓冲液重悬,即为粗酶液。