1.一种短小芽胞杆菌CotA漆酶的突变体,其特征在于,是以L386W单突变的短小芽胞杆菌CotA漆酶基因为模板将其第417位的Gly突变为Leu。
2.权利要求1所述的突变体的制备方法,包括如下步骤:
(1)以前期构建的单突变体质粒pColdII-CotA(W)为模板,采用滚环PCR的方法,设计引物时在重叠区域引入突变位点,利用PCR扩增质粒pColdII-CotA(W)得到含有编码CotA漆酶突变体的基因序列的开环重组载体;
(2)在PCR产物中加DMT酶消化PCR产物,然后进行1%琼脂糖凝胶电泳回收片段;
(3)利用特殊的重组酶和同源重组原理,将开环重组载体无缝拼接,形成环状结构;
(4)将环状质粒转化到DMT感受态细胞中,平板培养挑取单菌落测序,为的是提取到正确突变质粒;
(5)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达。
3.根据权利2所述的方法,其特征在于,还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和HisTrap HP 1mL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。
4.根据权利2所述的方法,其特征在于,将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜,后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600≈0.5,迅速降温至15℃静置至少30min,加入最终浓度0.4mM的诱导剂IPTG诱导,
24h时离心获得沉淀,用缓冲液重悬,即为粗酶液。复合突变体L386W/G417L对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的专一性,是野生型的4.3倍,且催化效率是野生型的1.8倍。