1.一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用,所述sll0659基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤如下:
(1)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803sll0659序列扩增集胞藻PCC6803sll0659上游cDNA片段,制得上游片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803sll0659序列扩增集胞藻PCC6803sll0659下游cDNA片段,制得下游片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(3)将步骤(1)制得的上游片段连接入载体,用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切,回收载体片段1,将步骤(2)制得的下游片段用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切,制得回收片段2,连接载体片段1和片段2,制得sll0659BamHI载体;
(4)用限制性内切酶BamHI酶切pBluescript-Gm载体,回收庆大霉素抗性片段;将步骤(3)制得的sll0659BamHI载体用限制性内切酶BamHI酶切后,与庆大霉素抗性片段连接,制得集胞藻PCC6803sll0659基因敲除的载体pKNsll0659-Gm;
(5)将步骤(4)制得的载体pKNsll0659-Gm转化集胞藻PCC6803,经筛选,制得转基因集胞藻,经培养,即得。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增引物核苷酸序列如下:sll0659-1-F:5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’;
sll0659-1-BamHI-R:5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增体系如下:
2×Hifi PCR Mix 10μL,大肠杆菌基因组DNA模板1μL,正向引物sll0659-1-F
1μL,反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为20μL。
5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增体系如下:
94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环后;
72℃10min,4℃保存。
6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增引物核苷酸序列如下:sll0659-2-BamHI-F:5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’;
sll0659-2-SalI-R:5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT-3’。
7.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增体系如下:
2×Hifi PCR Mix 10μL,大 肠 杆 菌 基 因 组 DNA 模 板1μL,正 向 引 物sll0659-2-BamHI-F1μL,反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为
20μL。
8.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增体系如下:
94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环后;
72℃10min, 4℃保存。
9.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,载体为T3载体。