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专利号: 2015105758617
申请人: 山东省农业科学院生物技术研究中心
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种sll0659基因在提高集胞藻类胡萝卜素中叶黄素、玉米黄素和α-胡萝卜素含量中的应用,所述sll0659基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,步骤如下:(1)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659上游cDNA片段,制得上游片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(2)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659下游cDNA片段,制得下游片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

(3)将步骤(1)制得的上游片段连接入载体,用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切,回收载体片段1,将步骤(2)制得的下游片段用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切,制得回收片段2,连接载体片段1和片段2,制得sll0659BamHI载体;

(4)用限制性内切酶BamHI酶切pBluescript-Gm载体,回收庆大霉素抗性片段;将步骤(3)制得的sll0659BamHI载体用限制性内切酶BamHI酶切后,与庆大霉素抗性片段连接,制得集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除的载体pKNsll0659-Gm;

(5)将步骤(4)制得的载体pKNsll0659-Gm转化集胞藻PCC6803,经筛选,制得转基因集胞藻,经培养,即得。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增引物核苷酸序列如下:sll0659-1-F:5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’;

sll0659-1-BamHI-R: 5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’。

3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增体系如下:

2×Hifi PCR Mix 10μL,大肠杆菌基因组DNA模板1μL,正向引物sll0659-1-F 1μL,反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为20μL。

4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,扩增反应条件如下:

94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环后;72℃10min,

4℃保存。

5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增引物核苷酸序列如下:sll0659-2-BamHI-F: 5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’;

sll0659-2-SalI-R: 5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT -3’。

6.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增体系如下:

2×Hifi PCR Mix 10μL,大肠杆菌基因组DNA模板1μL,正向引物sll0659-2-BamHI-F 1μL,反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为20μL。

7.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩增反应条件如下:

94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环后;72℃10min,

4℃保存。

8.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,载体为T3载体。