1.一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用,所述的sll0147基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤如下:
(1)以psbA2ORF前500bp片段为启动子片段,与sll0147基因进行基因融合,制得融合片段Promotor+sll0147;
所述psbA2ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
(4)通过对质粒pKK233-2进行扩增,向大肠杆菌T1T2终止子中引入PstI、BamHI酶切位点,经PstI、BamHI内切酶酶切后,与同样经PstI、BamHI内切酶酶切的质粒pBluescript SK连接,制得质粒pBluescript SK T1T2;
(5)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段,与同样经KpnI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒pBluescript SK T1T2连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U;
(6)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段,与同样经SacI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD;
(7)用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Gm,回收庆大霉素抗性Gm片段,与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD;
(8)将步骤(1)制得的融合片段Promotor+sll0147经SalI、EcoRI内切酶酶切后,与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(7)制得的质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD连接,制得重组载体p5S1285UDsll0147;
(9)将步骤(8)制得的重组载体p5S1285UDsll0147转化集胞藻PCC6803,经筛选,制得转基因集胞藻,然后经培养,提取,制得类胡萝卜素。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2终止子的扩增引物的核苷酸序列如下:T1T2-F:5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’;
T1T2-R:5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2终止子的扩增程序如下:
94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸30s,35个循环后,
72℃10min,4℃保存。
5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2终止子的扩增体系如下:
2×Hifi PCR Mix 10μL,大肠杆菌基因组DNA模板1μL,正向引物T1T2-F 1μL,反向引物T1T2-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为20μL。
6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(9)中的培养条件为:在28~-2 -1
32℃、35~45μE·m ·s 持续光照条件下,于BG-11培养基中振荡培养。