1.一种sll0147基因在提高集胞藻类胡萝卜素中蓝藻叶黄素和玉米黄素含量中的应用,所述的sll0147基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;步骤如下:(1)以psbA2 ORF前500bp片段为启动子片段,与sll0147基因进行基因融合,制得融合片段Promotor+sll0147;
所述psbA2 ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段,核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
(4)通过对质粒pKK233-2进行扩增,向大肠杆菌T1T2 终止子中引入PstI、BamHI酶切位点,经PstI、BamHI内切酶酶切后,与同样经PstI、BamHI内切酶酶切的质粒pBluescript SK连接,制得质粒pBluescript SK T1T2;
(5)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段,与同样经KpnI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒pBluescript SK T1T2连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U;
(6)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段,与同样经SacI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD;
(7)用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Gm,回收庆大霉素抗性Gm片段,与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD连接,制得质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD;
(8)将步骤(1)制得的融合片段Promotor+sll0147经SalI、EcoRI内切酶酶切后,与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(7)制得的质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD连接,制得重组载体p5S1285UDsll0147;
(9)将步骤(8)制得的重组载体p5S1285UDsll0147转化集胞藻PCC6803,经筛选,制得转基因集胞藻,然后经培养,提取,制得类胡萝卜素。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增引物的核苷酸序列如下:T1T2-F :5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’;
T1T2-R :5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增程序如下:
94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸30s,35个循环后,72℃ 10min,
4℃保存。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增体系如下:
2×Hifi PCR Mix 10μL,大肠杆菌基因组DNA模板1μL,正向引物T1T2-F 1μL,反向引物T1T2-R 1μL,ddH2O 7μL,总反应体系为20μL。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(9)中的培养条件为:在28~32℃、
35~45 μE·m-2·s-1持续光照条件下,于BG-11培养基中振荡培养。