1.一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法,包括以下步骤:
(1)取10μL链霉亲和素修饰磁珠至1mL离心管中,并用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍,并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中;发卡DNA在使用之前在95℃条件下孵化2min,然后逐步降温至室温备用;
(2)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液,然后加入10μL 1.0×10-5M生物素化的Seq.16,并在37℃下振荡反应1h,然后,再加入10μL 1.0×10-5M DNA1,得到Seq.16/DNA1修饰的磁珠,并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍,并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中;
(3)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液,然后加入10μL 1.0×10-5M的DNA2,并在37℃下振荡反应1h,得到发卡DNA2修饰的磁珠,用磷酸缓冲溶液洗涤3遍,并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中;
(4)在100μL含有Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中加入T-2毒素的样品溶液100μL,在37℃下振荡反应,T-2毒素与Seq.16作用,使得DNA1脱离Seq.16/DNA1修饰的磁珠表面,1h后,磁性分离,取含DNA1的清液加到100μL发卡DNA2修饰的磁珠溶液中,37℃下振荡反应,DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域,在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应,将DNA2的发卡结构打开,并形成新的双链DNA,1h后,加入
100μL 1.0×10-7M FITC-H1和1.0×10-7M FITC-H2的溶液,并在37℃振荡反应1h;然后,进行磁性分离,除去清液后,将磁珠用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍,然后分散于
100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液中;取200μL pH 11.3浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中,并加入上述所得50μL磁珠溶液;打开光二极管电源,照射15秒后关闭电源,测定化学发光强度,根据化学发光强度实现目标物的测定。
2.权利要求1的一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法,其特征在于所述的DNA部分序列如下:
Seq.16:5’-biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTG TTT ACA CAT GCG AGA GGT GAA GAC TCG AAG T-3’DNA1:5’-GGA TCA CAG GAT CAA GCT TC-3’;
DNA2:5’-GAA GCT TGA TCC TGT GAT CCT AGC ACC TAG ATC GAC GTA GGC TAG GAT CAC AGG AT-3’;
FITC-H1:5’-FITC-GCT AGG ATC ACA GGA TGT GTG TCC AGT GCA AAA TCC TGT GAT CCT AGC CTA CGT CGA TCT AGG T-3’;
FITC-H2:5’-TTT GCA CTG GAC ACA CAT CCT GTG ATC CTA GCA CCT AGA TCG ACG TAG GCT AGG ATC ACA GGA T-FITC-3’。