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专利号: 2015101796319
申请人: 南通大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组载体,所述的表达载体为原核表达质粒pET22b。

2.一种含有如SEQ ID NO:3或4所示核苷酸序列的重组菌;所述的重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法,其特征在于,所述的融合蛋白RT-X的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述的方法包括如下步骤:A、构建含有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的重组载体,所述的表达载体为原核表达质粒pET22b;

B、将步骤A获得的重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达的融合蛋白RT-X进一步分离纯化。

4.根据权利要求3所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法,其特征在于,所述步骤A中,设计并合成引物如下:引物1如SEQ ID NO:6所示;

引物2如SEQ ID NO:7所示。

5.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法,其特征在于,所述步骤B为:将构建成功的重组载体从克隆菌中提取出后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,对长出的单克隆菌落进行诱导表达融合蛋白RT-X,通过电泳选取高效表达可溶性RT-X的菌株;将该菌株在25℃-30℃低温和0.3-0.6mM的IPTG诱导下表达;超声破碎后,通过一步亲和层析可以得到纯化的融合蛋白RT-X。

6.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法,其特征在于,所述步骤B中,0.3-0.6mM的IPTG诱导表达;表达菌体超声破碎细胞,8000rpm离心

10min收集菌体。

7.根据权利要求3或4所述的一种在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法,其特征在于,所述步骤B中,RT-X的分离纯化步骤如下:

1L表达菌体用50mL超声液悬浮,所述的超声液为50mMTris-Cl、pH7.5、20mM咪唑,冰浴超声20min、5s超声、5s间隔;

超声后的混合物12000rpm,4℃离心30min;

将表达上清直接进行Ni-NTA层析:柱床平衡洗涤用50mMNaCl,50mMTris-Cl,pH7.5,

50mM咪唑,用50mMNaCl,50mMTris-Cl,pH7.5,150mM咪唑洗脱,将洗脱液透析后超滤浓缩。

8.一种如权利要求3至7任一所述的在大肠杆菌中生产融合蛋白RT-X的方法制备得到的血管生成抑制剂。