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专利号: 2014103158498
申请人: 西南大学柑桔研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体,包括骨架载体和正、反义链,其特征在于:以桔小实蝇钠离子通道基因部分片段为正或反义链,所述钠离子通道基因部分片段序列如SEQ ID NO.1,所述骨架载体为PFGC5941载体。

2.根据权利要求1所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体,其特征在于:所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间,反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间。

3.根据权利要求2所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体的构建方法,包括如下步骤:

1)钠离子通道基因目的片段与质粒的连接

提取桔小实蝇总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板,以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物对钠离子通道基因的正向目的片段进行PCR扩增,以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物对钠离子通道基因的反向目的片段进行PCR扩增,得到PCR产物,目的片段约为550bp,回收PCR产物,与载体pMD-19连接,转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD-19-C1R1和pMD-19-C2R2,进行序列验证,测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建;所述SEQ ID NO.2~5的序列如下:SEQ ID NO.2:5’-GCCATGGCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3’;

SEQ ID NO.3:5’-CCATGGATATCGCCATGTATAGTGAA-3’;

SEQ ID NO.4:5’-GCTCTAGAGCCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3’;

SEQ ID NO.5:5’-CGGGATCCATATCGCCATGTATAGTGAA-3’;

2)钠离子通道基因的RNA干扰载体的构建

将上述测序正确的钠离子通道基因正向目的片段质粒pMD-19-C1R1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切,将pMD-19-C1R1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-C1R1;将PFGC5941-C1R1和钠离子通道基因反向目的片段质粒pMD-19-C2R2分别用XbalI和BamHI双酶切,将酶切产物进行连接,即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-C1R1/C2R2,经PCR扩增检测、核苷酸序列分析,目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。

4.权利要求1-2任一所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体在转基因植物中的应用,所述转基因植物为柑橘属植物。

5.根据权利要求4所述的应用,为将权利要求1-2任一所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体转化有关受体植物,使之对桔小实蝇产生抗性,所述受体植物为柑桔。

6.根据权利要求5所述的应用,所述转化的方法为农杆菌介导法。

7.根据权利要求6所述的应用,所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。