1.一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建方法,其特征在于:以PFGC5941载体作为骨架载体,以桔小实蝇细胞色素P450基因部分片段为正或反义链,所述细胞色素P450基因部分片段序列如SEQ ID NO.1,所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间,反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间;具体包括如下步骤:
1)细胞色素P450基因目的片段与质粒的连接
提取桔小实蝇总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板,以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物对细胞色素P450基因的正向目的片段进行PCR扩增,以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物对细胞色素P450基因的反向目的片段进行PCR扩增,得到PCR产物,目的片段约为
600bp,回收PCR产物,与载体pMD-19连接,转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2,进行序列验证,测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建;所述SEQ ID NO.2~5的序列如下:SEQ ID NO.2:5’-GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3’;
SEQ ID NO.3:5’-CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3’;
SEQ ID NO.4:5’-GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3’;
SEQ ID NO.5:5’-CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3’;
2)细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建
将上述测序正确的细胞色素P450基因正向目的片段质粒pMD-19-P1F1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切,将pMD-19-P1F1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-P1F1;将PFGC5941-P1F1和细胞色素P450基因反向目的片段质粒pMD-19-P2F2分别用XbalI和BamHI双酶切,将酶切产物进行连接,即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-P1F1/P2F2,经PCR扩增检测、核苷酸序列分析,目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。