1.一种用于柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的SSR分子标记引物体系,其特征在于,包括33对Las-SSR可用引物,分别为Las-ssr1~Las-ssr8、Las-ssr10~Las-ssr14、Las-ssr16~Las-ssr20、Las-ssr22~ Las-ssr36,引物序列如SEQ ID NO.1~16、SEQ ID NO.19~28、SEQ ID NO.31~40、SEQ ID NO.43~72所示。
2.根据权利要求1所述SSR分子标记引物体系,其特征在于,所述33对Las-SSR可用引物中有18对为SSR核心引物,分别是Las-ssr1、Las-ssr3、Las-ssr5、Las-ssr7、Las-ssr12~14、Las-ssr18、Las-ssr22、Las-ssr27~29、Las-ssr31~36,引物序列如SEQ ID NO.1~2、SEQ ID NO.5~6、SEQ ID NO.9~10、SEQ ID NO.13~14、SEQ ID NO.23~28、SEQ ID NO.35~36、SEQ ID NO.43~44、SEQ ID NO.53~58、SEQ ID NO.61~72所示。
3.一种权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1. 柑橘黄龙病菌亚洲种全基因组序列的获得:从Genebank中下载得到2个柑橘黄龙病菌亚洲种菌株序列,Genebank ID: gb∣CP001677.5和gb∣CP004005.1;
S2.全基因组序列中SSR位点的鉴定:利用SSR检索软件获得了36个含有SSR位点信息的序列;
S3.根据S2得到的36个含有SSR位点的序列设计得到36对Las-SSR引物;
S4.用普通PCR的方法验证S3得到引物的特异性,筛选得到33对Las-SSR可用引物;
S5.利用S4筛选到的33对Las-SSR可用引物对柑橘黄龙病菌亚洲种进行遗传多样性分析,筛选得到18对SSR核心引物;
其中,步骤S3所述36对Las-SSR引物为Las-ssr1~ Las-ssr36,序列如SEQ ID NO.1~72所示;
步 骤 S4 所 述 33 对 Las-SSR 可 用 引 物 分 别 为 Las-ssr1~Las-ssr8、Las-ssr10~Las-ssr14、Las-ssr16~Las-ssr20、Las-ssr22~ Las-ssr36,引物序列如SEQ ID NO.1~16、SEQ ID NO.19~28、SEQ ID NO.31~40、SEQ ID NO.43~72所示;
步骤S5所述18对SSR核心引物分别为Las-ssr1、Las-ssr3、Las-ssr5、Las-ssr7、Las-ssr12~14、Las-ssr18、Las-ssr22、Las-ssr27~29、Las-ssr31~36,引物序列如SEQ ID NO.1~2、SEQ ID NO.5~6、SEQ ID NO.9~10、SEQ ID NO.13~14、SEQ ID NO.23~28、SEQ ID NO.35~36、SEQ ID NO.43~44、SEQ ID NO.53~58、SEQ ID NO.61~72所示。
4.一种利用权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法,其特征在于,包括如下步骤:S1.实验材料的准备:选取典型斑驳症状的柑橘叶片,提取柑橘样品叶中脉总DNA,采用国际上通用的柑橘黄龙病菌特异引物OI1和OI2c扩增16S rDNA片段,检测为阳性的DNA样品进行SSR遗传多样性分析;
S2.以S1获得的阳性的DNA为模板,利用本发明的SSR分子标记引物体系进行PCR扩增;
S3.对S2所述PCR扩增得到的PCR产物进行电泳、显色,显色结束后,拍照获取谱带信息,比较同一SSR标记在不同菌株中的多态性;
S4.结果统计及遗传多样性分析:读取S3获得的谱带信息,以条带位置为依据,最小片段的带型为“1”,依次递增;收集所有条带类型信息,使用分析软件分别计算SSR标记的多态性位点频率、Nei's基因多样性指数和Shannon's信息指数,反映菌株的遗传多样性;采用相关软件方法进行分析,获得UPGMA聚类图。
5.根据权利要求4所述方法,其特征在于,步骤S3所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。