1.一种脯氨酸脱氢酶,其特征在于,来源于Pseudomonas xantholysinigenes,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,对目的基因进行密码子优化,优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的脯氨酸脱氢酶的突变体,其特征在于,所述突变体的氨基酸序列是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第549位酪氨酸、第434位酪氨酸、第568位酪氨酸、第
368位丙氨酸中的一个或多个位点发生突变得到的氨基酸序列,所述突变至少包括如下突变位点之一:Y434Q、Y434M、Y568I、Y549L、A368M、A368K、Y549L+Y434M、A368M+Y434M;其中氨基酸缩写含义如下:A‑丙氨酸,L‑亮氨酸,I‑异亮氨酸,Y‑酪氨酸,K‑赖氨酸,Q‑谷氨酰胺,M‑甲硫氨酸。
3.一种如权利要求1所述的脯氨酸脱氢酶的应用,其特征在于,应用包括以下步骤:
(1)重组大肠杆菌构建:将SEQ ID NO.2所示DNA片段利用NheI和HindIII酶切位点克隆到表达载体pET28a(+),得到pET28a(+)‑PxPutA重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得高表达的重组大肠杆菌;
(2)发酵培养:挑取步骤(1)单菌落,接种至5mL LB试管(硫酸卡那霉素抗性)过夜培养,以2%的接种量转接至含硫酸卡那霉素50μg/mL的TB培养基,37℃培养2h加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L,18℃低温继续培养24小时,结束发酵,发酵液中细胞不经分离直接投入底物进行反应;
(3)DL‑脯氨酸中L‑脯氨酸的降解:将发酵得到的步骤(2)的菌液通过全细胞催化法降解L‑脯氨酸,从而得到高纯度D‑脯氨酸,DL‑脯氨酸的初始浓度为30‑50g/L,重组大肠杆菌湿细胞菌液加量为20‑30g/L,反应温度范围为20℃~40℃,降解时间为24‑36h。
4.一种如权利要求2所述脯氨酸脱氢酶突变体的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(1)重组大肠杆菌构建:以SEQ ID NO.2所示DNA片段为模板进行位点突变PCR,构建含有突变位点的编码基因的重组质粒,突变体质粒转到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,获得高表达的重组大肠杆菌;
(2)发酵培养:挑取步骤(1)单菌落,接种至5mL LB试管(硫酸卡那霉素抗性)过夜培养,以2%的接种量转接至含硫酸卡那霉素50μg/mL的TB培养基,37℃培养2h加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L,18℃低温继续培养24小时,结束发酵,发酵液中细胞不经分离直接投入底物进行反应;
(3)DL‑脯氨酸中L‑脯氨酸的降解:将发酵得到的步骤(2)的菌液通过全细胞催化法降解L‑脯氨酸,从而得到高纯度D‑脯氨酸,DL‑脯氨酸的初始浓度为30‑50g/L,重组大肠杆菌湿细胞菌液加量为20‑30g/L,反应温度范围为20℃~40℃,降解时间为24‑36h。