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专利号: 2024118701353
申请人: 西南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种牛赤羽病病毒重组N蛋白抗原,其特征在于,其氨基酸序列为SEQIDNo .2所示。

2.编码权利要求1所述牛赤羽病病毒重组N蛋白抗原氨基酸序列的基因,其特征在于,所述基因序列如SEQIDNo .1所示。

3.权利要求1所述牛赤羽病病毒重组N蛋白抗原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、引物的设计和合成

上游引物AKAV‑N‑F:5’‑CCGGAATTCATTTTCAACGATGTTC‑3’;

下游引物AKAV‑N‑R:5’‑CCGCTCGAGTCTGAATACCAAATTGAG‑3’;下划线处分别为添加的EcoR I和 Xho I酶切位点序列;

S2、N基因的扩增

提取牛赤羽病病毒的RNA,并利用反转录酶进行逆转录,以此作为模板进行PCR扩增,得到N基因的PCR扩增产物,测序确定序列如SEQIDNo .1所示;

S3、N基因原核表达载体的构建与表达

S31、将pET28a载体质粒和N基因的PCR扩增产物进行酶切,分别胶回收其产物;

S32、将酶切后的pET28a载体质粒和酶切后的N基因的PCR扩增产物经连接酶进行连接;

S33、将步骤S32所得的连接产物转化至Top10感受态细胞,构建表达载体pET28a‑N;通过FlyCut EcoR I和FlyCut Xho I双酶切及测序对构建的表达载体pET28a‑N质粒进行鉴定;

S34、将构建成功的表达载体pET28a‑N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,培养后挑取阳性单克隆菌落扩大培养,制备蛋白样品,将蛋白样品进行SDS‑PAGE电泳检测和考马斯亮蓝染色分析;将成功表达的重组N蛋白分装保存、备用;

S4、N蛋白的纯化及反应活性鉴定

将步骤S34所得的成功表达的重组N蛋白进行纯化,测定纯化后重组N蛋白的浓度,并鉴定重组N蛋白的活性。

4. 如SEQ ID No.1所示基因在制备牛赤羽病抗体检测试剂盒中的应用。

5.如SEQ ID No.2所示基因编码的牛赤羽病病毒重组N蛋白抗原在制备牛赤羽病抗体检测试剂盒中的应用。

6.一种用于牛赤羽病病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒,其特征在于,包括包被有权利要求1所述牛赤羽病病毒重组N蛋白的酶标板、酶标二抗、洗涤液、终止液、阴性对照、阳性对照及其结果判定标准。

7.根据权利要求6所述的用于牛赤羽病病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒,其特征在于,所述牛赤羽病病毒重组N蛋白的酶标板的制备方法为:A1、将牛赤羽病病毒重组N蛋白包被至酶标板,在温度为37℃ 孵育2h;

A2、取出后甩出孔内液体,洗涤液洗涤,拍干孔内液滴;

A3、加入封闭液,在温度为37℃孵育2h;

A4、取出后甩出孔内液体,洗涤液洗涤后,拍干孔内液滴,37℃温箱风干,即得牛赤羽病病毒重组N蛋白的酶标板。

8.根据权利要求7所述的用于牛赤羽病病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒,其特征在于,所述步骤A1中,制备牛赤羽病病毒重组N蛋白的酶标板采用的牛赤羽病病毒重组N蛋白的浓度为7μg/mL。

9.根据权利要求7所述的用于牛赤羽病病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒,其特征在于,所述所述步骤A3中,所述封闭液为质量百分比浓度3%‑5%的BSA、质量百分比浓度0.3%的明胶封闭缓冲液或质量百分比浓度5%的脱脂奶粉。

10.根据权利要求6所述的用于牛赤羽病病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒,其特征在于,所述间接ELISA试剂盒还包含样品稀释液,所述样品稀释液的配置原料包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、表面活性剂、去离子水、防腐剂,稀释液的pH值为7.4;

所述洗涤液的配置原料包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、表面活性剂、去离子水,洗涤液的pH值为7.4;

所述终止液的配置原料包括浓硫酸和去离子水,终止液的pH值为0.4。