1.一种NK细胞的分离、培养、激活的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)分离NK细胞：通过Ficoll‑Hypaque梯度离心法从健康成人外周血中分离单核细胞，并利用负选择法去除T细胞、B细胞和单核细胞，从而富集NK细胞群体；

(2)培养NK细胞：将分选后的NK细胞接种在RPMI‑1640培养基中，加入10％胎牛血清和

1％青霉素/链霉素，同时添加50IU/mL的IL‑2和10ng/mL的IL‑15进行扩增，培养14天，每3天更换一次培养基；

(3)激活NK细胞：在培养第7天，添加10ng/mL的IL‑21和5ng/mL的IL‑12，联合刺激NK细胞，增强其细胞毒性；

(4)肿瘤抗原诱导激活：在第7天细胞因子激活后，收集培养的NK细胞，在激活后的NK细胞中加入肿瘤抗原刺激；并在第10天，添加抗CD16单克隆抗体进一步增强NK细胞的杀伤能力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原为MC‑38结肠癌细胞，其中6

MC‑38结肠癌细胞约1×10个/mL，并与NK细胞按照1:1的比例混合，将细胞混合物接种到培养皿中，补充完整RPMI‑1640培养基，确保细胞充分接触并共同培养48小时，以评估NK细胞的抗肿瘤效果。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗CD16单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD16单克隆抗体终浓度为10μg/mL。

5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括权利要求1制备的NK细胞和抗PD‑1单域抗体。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的抗PD‑1单域抗体的VNAR序列如SEQ ID NO.3所示。

6

7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的药物每周同时注射1×10 个NK细胞与20mg/kg抗PD‑1单域抗体。

8.一种如权利要求3所述的抗CD16单克隆抗体在NK细胞激活中的应用。

9.一种如权利要求6所述的抗PD‑1单域抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。