1.一种用于脂肪间充质干细胞外泌体免疫亲和捕获的磁珠,其特征在于,所述磁珠偶联有特异性结合Nrf2蛋白的单克隆抗体1和特异性结合CD63蛋白的单克隆抗体2;其中单克隆抗体1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的磁珠,其特征在于,所述特异性结合CD63蛋白的单克隆抗体2的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.一种脂肪间充质干细胞外泌体的制备和纯化方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)脂肪干细胞的培养,包括脂肪干细胞的复苏、脂肪干细胞传代培养和脂肪干细胞无外泌体培养基处理;
(2)脂肪干细胞外泌体分离与纯化,包括:脂肪干细胞培养上清的收集、超速离心分离纯化外泌体和免疫亲和捕获纯化外泌体,所述免疫亲和捕获纯化外泌体是使用权利要求1制备的磁珠从超速离心分离纯化外泌体中筛选高表达Nrf2蛋白和CD63蛋白的外泌体。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的脂肪干细胞培养上清的收集包括以下步骤:收集培养24小时后的细胞培养上清液,1000rpm离心10分钟,去除细胞碎片;将上清液过0.22μm滤膜后,转移至100KD的超滤管中,在4℃4000rpm离心30min,即可得到含外泌体的浓缩液,将含外泌体的浓缩液以4℃10000g离心30分钟,进一步去除凋亡小体。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的超速离心分离纯化外泌体包括以下步骤:将权利要求4制备的含外泌体的浓缩液移至超速离心管中,在4℃100000g离心70分钟,沉淀即为外泌体;小心弃去上清,使用适量PBS重悬沉淀,再以100000g离心70分钟;小心弃去上清,使用适量PBS重悬沉淀,即为收集的外泌体。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的免疫亲和捕获纯化外泌体包括以下步骤:取1ml收集的权利要求5制备的外泌体,加入到含1ml权利要求1的磁珠中,待混合均匀后,在室温下旋转孵育1小时,使抗体与外泌体充分结合;将样品转移到磁力架上,分离出带有抗体的磁珠,并吸走上清液;使用清洗缓冲液对磁珠上的外泌体进行3次清洗;每次加入1mlPBS缓冲液,旋转混合5min,再使用磁力架分离磁珠,并弃去上清液;加入
0.2ml洗脱缓冲液,旋转混合5min,重复3次,收集洗脱液,再对PBS 4℃透析过夜后即为特异性外泌体,所得特异性外泌体使用0.22μm过滤,置于‑80℃保存备用。
7.一种如权利要求1所述的特异性结合Nrf2蛋白的单克隆抗体1在制备脂肪间充质干细胞外泌体免疫亲和捕获磁珠中的应用。
8.一种如权利要求1所述的特异性结合CD63蛋白的单克隆抗体2在制备脂肪间充质干细胞外泌体免疫亲和捕获磁珠中的应用。