利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2024109291538
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组,包括第一引物组和第二引物组,其特征在于,所述第一引物组的序列包括:上引物:CTGAAGTCTGGCACTAAGCTTTCC,下引物:GTCTAAATTCCGAAGCGGGTAAAA;所述第二引物组的序列包括:上引物:TAGCCCCGAGATTATCAGAGACAG,下引物:TGTGGCTGGTTGGTGTAGTAAGAA。

2.根据权利要求1所述的一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组,其特征在于,所述微卫星引物组在黄沙鳖品种鉴定中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:对黄沙鳖、日本鳖、洞庭鳖、黄河鳖、长永鳖、乌鳖6个群体每个群体10只鳖采集裙边进行Super‑GBS测序,使用MISA软件查找SSR位点,将查找到的SSR与InDel取交集;

S2:随机选取113个SSR标记,使用Primer软件设计上下游引物;

S3:合成引物,从每个群体中随机选取10个样本DNA混合制成DNA混样作为PCR反应模板,用于SSR标记的初步筛选,进行PCR反应,将PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测,筛选出产物正确、条带清晰、单条带的标记引物;

S4:将S3获得的标记引物,同样使用DNA混样根据每对上下游引物的平均Tm值,使用平均Tm值±5℃的温度进行梯度PCR扩增,扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测,根据条带清晰度筛选出最佳扩增温度;

S5:从6个群体中随机挑选2个群体的DNA单样,将S3筛选获得的标记引物,使用最佳退火温度进行PCR扩增,扩增产物使用8%琼脂糖凝胶电泳检测,进行微卫星标记的复筛,电泳完成后进行硝酸银染色,胶片拍照记录,筛选出多态性好,条带清晰的引物;

S6:将S5中筛选获得引物,使用S3制备的6个群体的DNA混样作为模板,在上引物的前端随机加上FAM、ROX、HEX、TAMRA四种荧光接头,在最佳退火温度下进行荧光PCR扩增,扩增产物进行毛细管电泳检测,根据每个群体的波形异同筛选出可以鉴定黄沙鳖与其他群体的SSR标记引物。

4.根据权利要求3所述的一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组的制备方法,其特征在于,所述S3中的PCR反应体系为:Mix12.5μL,Primer 1μL,DNA 1μL,H2O 9.5μL,扩增反应程序为:95℃5min,94℃30s,56‑61℃30s,72℃1min 35×,72℃5min。

5.根据权利要求3所述的一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组的制备方法,其特征在于,所述S5中PCR产物与DNA marker上样量均为1.5μL,电泳缓冲液为1×TBE,180V电压预电泳1h,300V电压正式电泳2.5h。

6.根据权利要求3所述的一种用于黄沙鳖品种鉴定的微卫星引物组的制备方法,其特征在于,所述S6中扩增反应体系及反应程序同S3。

7.一种用于黄沙鳖品种的鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1:黄沙鳖、日本鳖、洞庭鳖、长永鳖、黄河鳖、乌鳖6个群体每个群体30只提取基因组DNA;

步骤2:使用权利要求1中提供的两组微卫星引物组对步骤1中得到的基因组DNA进行PCR扩增和毛细管电泳检测。