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专利号: 2023106555205
申请人: 江苏科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-02
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种2‑苯乙醇诱导型启动子,其特征在于,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种含有权利要求1所述的2‑苯乙醇诱导型启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.一种重组表达载体pUUa,其特征在于,所述重组表达载体pUUa包括权利要求1所述的

2‑苯乙醇诱导启动子、筛选标签URA3、Pichia kudriavzevii YK116的基因组整合位点25S rDNA和转录终止子TAOX1。

4.一种权利要求3所述的重组表达载体pUUa的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)以库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YK116的基因组为模板,PCR扩增25S rDNA的上游整合位点序列25Sup,将其连接至质粒pUC19,得到pUC19‑25Sup;以库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YK116的基因组为模板,PCR扩增25S rDNA的下游整合位点序列25Sdown,将其连接至pUC19‑25Sup,得到pUC19‑25Sup‑25Sdown,重新命名为pUC19‑25S;

(2)以库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)CICC 33179的基因组为模板,PCR扩增URA3的基因序列,将其连接至pUC19‑25S,得到pUC19‑25S‑URA3;

(3)以质粒pPIC9K为模板,PCR扩增质粒pPIC9K的终止子TAOX1的基因序列,将其连接至pUC19‑25S‑URA3,得到pUC19‑25S‑URA3‑TAOX1;

(4)以库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)YK116的基因组为模板, PCR扩增权利要求1所述的2‑苯乙醇诱导启动子PAIM2序列,将其连接至pUC19‑25S‑ URA3‑TAOX1,得到pUC19‑25S‑URA3‑TAOX1‑PAIM2,即为含有2‑苯乙醇诱导型启动子表达载体pUUa。

5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中PCR扩增上游整合位点序列

25Sup使用的引物对包括25Sup‑F和25Sup‑R,引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.9 10所示;

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PCR扩增下游整合位点序列25Sdown使用的引物对包括25Sdown‑F和25Sdown‑R,引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.11 12所示。

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6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中PCR扩增URA3基因使用的引物对为URA3‑F和URA3‑R,引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.13 14所示。

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7.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中PCR扩增TAOX1基因使用的引物对为TAOX1‑F和TAOX1‑R,引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示。

8.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(4)中PCR扩增PAIM2序列使用的引物对为PAIM2‑F和PAIM2‑R,引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.17~18所示。

9.一种2‑苯乙醇高产量重组菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)将苯丙酮酸脱羧酶ARO10的核苷酸序列连接至权利要求3所述的表达载体 pUUa,获得重组质粒pUUa‑ARO10;

(2)以重组质粒pUUa‑ARO10为模板,扩增重组表达框25S‑PAIM2‑ARO10‑TAOX1‑ URA3‑25S核酸片段,将其转入宿主细胞中,获得2‑苯乙醇高产量重组菌,所述苯丙酮酸脱羧酶ARO10的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所用扩增引物为M13 rev和M13 fwd,扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19 20所示;所述宿主细胞为Pichia kudriavzevii YK116。

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10.一种权利要求9的制备方法制备得到的重组菌在发酵生产2‑苯乙醇中的应用。