1.一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:所述方法为降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平,其中降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平是通过RNA干扰(RNAi)实现的;所述方法包括以下步骤:(1)克隆柑橘CsEXPA8的干扰序列;克隆方法为:提取柑橘总RNA,然后反转录为cDNA,以cDNA为模板采用PCR扩增得到干扰序列;所述PCR扩增所采用的引物为rCsEXPA8‑F和rCsEXPA8‑R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(2)进行包含干扰序列的CsEXPA8干扰表达载体构建;
(3)CsEXPA8干扰表达载体转化柑橘得到转基因柑橘植株。
2.根据权利要求1所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:步骤(2)中,CsEXPA8干扰表达载体构建方法为:A.构建出正向干扰序列载体:利用AscI和SwaI分别双酶切pUC‑RNAi载体和含有所述干扰序列的T‑克隆载体,用T4‑DNA连接酶将酶切后的pUC‑RNAi载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接;
B.构建CsEXPA8干扰表达载体:将步骤A得到的正向干扰序列载体和含有所述干扰序列的T‑克隆载体再分别利用XbaI和BamHI进行双酶切,用T4‑DNA连接酶将酶切后的正向干扰序列载体大片段和干扰序列片段连接,获得同时包含正向和反向干扰序列片段的pUC‑RNAi‑CsEXPA8干扰载体;最后,利用KpnI和SalI分别双酶切所述pUC‑RNAi‑CsEXPA8干扰载体和pLGNe载体,利用T4‑DNA连接酶将酶切后的所述正向和反向干扰序列片段和线性化的pLGNe载体连接。
3.根据权利要求2所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:步骤(3)中,用所述CsEXPA8干扰表达载体转化柑橘的方法为:通过冻融法将所述CsEXPA8干扰表达载体导入农杆菌菌株EHA105中,再用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴茎段,经离体培养后、染色鉴定和嫁接得到转基因柑橘植株。
4.根据权利要求3所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:步骤(3)得到转基因柑橘植株后,对转基因柑橘植株进行抗性评价,通过活体植株接种溃疡病菌,判定活体植株中CsEXPA8基因干扰与柑橘溃疡病抗性的相关性。
5.根据权利要求4所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:对转基因柑橘植株进行抗性评价前,通过PCR验证转基因柑橘植株,采用的引物为GUS‑F和GUS‑R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求5所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于:PCR验证后,用qRT‑PCR验证转基因柑橘植株中CsEXPA8基因的转录水平,检测所采用的引物为qCsEXPA8‑f和qCsEXPA8‑r,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示;内参基因为柑橘Actin基因,采用引物为Actin‑F和Actin‑R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。