1.一种提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：在灵芝中过表达SREBP基因，具体为：利用多克隆位点区，在农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300中插入从灵芝中克隆的gpd基因启动子以及SREBP基因，得过表达载体，记为GLgpd‑SREBP；以潮霉素抗性基因为标记基因，通过农杆菌介导转化法，将过表达载体GLgpd‑SREBP转入灵芝原生质体细胞，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株；所述SREBP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述gpd基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述灵芝的保藏编号为CGMCC No.18819。

2.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以含gpd基因启动子的灵芝基因组DNA为模板，设计引物扩增gpd基因启动子片段，得gpd基因启动子的PCR扩增产物，连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300上，得载体，记为GLgpd；

（2）以灵芝cDNA为模板，设计引物扩增SREBP基因，得SREBP基因的PCR扩增产物，连接到步骤（1）所得载体GLgpd上，得过表达载体GLgpd‑SREBP；

（3）将步骤（2）所得过表达载体GLgpd‑SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞中，活化后，加入灵芝原生质体细胞溶液中，以潮霉素作为筛选抗生素，介导转化灵芝原生质体细胞，筛选转基因灵芝菌株，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株。

3.根据权利要求2所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述gpd基因启动子的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:3、4；所述gpd基因启动子的PCR扩增产物连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300的方法是：在gpd基因上游引物的5’端设计EcoR I酶切位点，下游引物的5’端设计BamH I酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行EcoR I和BamH I双酶切处理，并将其连接入经EcoR I和BamH I双酶切处理的农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300质粒中，即成。

4.根据权利要求2或3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述SREBP基因的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:5、6；所述SREBP基因的PCR扩增产物连接到步骤（1）所得载体GLgpd的方法是：在SREBP基因上游引物的5’端设计Xba I酶切位点，下游引物的5’端设计Hand III酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行Xba I和Hand III双酶切处理，并将其连接入经Xba I和Hand III双酶切处理的载体GLgpd质粒中。

5.根据权利要求2或3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述过表达载体GLgpd‑SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞的方法是：1）取50μL 的EHA105农杆菌感受态，于冰盒解冻后，加入3～5μL的质粒，冰浴4～6min；2）液氮速冻4～6min后，36～38℃水浴4～6min，再冰浴1～3min；3）加入800μL带有利福平的YEB培养基，26～30℃，150～

250rpm培养3～4 h；4）6000～10000rpm离心1～3min，富集菌体弃上清，重悬菌液后，涂布至带有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，26～30℃，倒置培养36～48h；5）菌液PCR鉴定。

6.根据权利要求4所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述过表达载体GLgpd‑SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞的方法是：1）取50μL 的EHA105农杆菌感受态，于冰盒解冻后，加入3～5μL的质粒，冰浴4～6min；2）液氮速冻4～6min后，36～38℃水浴

4～6min，再冰浴1～3min；3）加入800μL带有利福平的YEB培养基，26～30℃，150～250rpm培养3～4 h；4）6000～10000rpm离心1～3min，富集菌体弃上清，重悬菌液后，涂布至带有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，26～30℃，倒置培养36～48h；5）菌液PCR鉴定。

7.根据权利要求2或3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述活化的具体方法是：将导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平和卡那霉素的液体YEB培养基中，一次摇床培养，离心，弃上清，用含乙酰丁香酮的IM诱导培养液重悬菌体后，二次摇床培养，至OD600=0.4～0.6，即成；所述菌液与液体YEB培养基的体积比为1:400～600；所述液体YEB培养基中，利福平和卡那霉素的浓度均为50～

150μg/mL；所述一次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为36～48h；所述离心的相对离心力为7000～8000g，时间为4～6min；所述菌液与IM诱导培养液的体积比为1:50～150；所述乙酰丁香酮在IM诱导培养液中的浓度为150～250μmol/L；所述重悬菌体至OD600=0.25～0.30；所述二次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为4～6h。

8.根据权利要求4所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述活化的具体方法是：将导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平和卡那霉素的液体YEB培养基中，一次摇床培养，离心，弃上清，用含乙酰丁香酮的IM诱导培养液重悬菌体后，二次摇床培养，至OD600=0.4～0.6，即成；所述菌液与液体YEB培养基的体积比为1:400～600；所述液体YEB培养基中，利福平和卡那霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述一次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为36～48h；所述离心的相对离心力为7000～8000g，时间为4～6min；所述菌液与IM诱导培养液的体积比为1:50～150；所述乙酰丁香酮在IM诱导培养液中的浓度为150～250μmol/L；所述重悬菌体至OD600=0.25～0.30；所述二次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为4～6h。

9.根据权利要求5所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述活化的具体方法是：将导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平和卡那霉素的液体YEB培养基中，一次摇床培养，离心，弃上清，用含乙酰丁香酮的IM诱导培养液重悬菌体后，二次摇床培养，至OD600=0.4～0.6，即成；所述菌液与液体YEB培养基的体积比为1:400～600；所述液体YEB培养基中，利福平和卡那霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述一次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为36～48h；所述离心的相对离心力为7000～8000g，时间为4～6min；所述菌液与IM诱导培养液的体积比为1:50～150；所述乙酰丁香酮在IM诱导培养液中的浓度为150～250μmol/L；所述重悬菌体至OD600=0.25～0.30；所述二次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为4～6h。

10.根据权利要求2或3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成；所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6；所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%；所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次；所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次；所述过滤的温度为0～8℃；所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min；用无菌甘露醇‑MES溶液重悬洗涤2～3次；重悬洗涤时，每次无菌甘露醇‑MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～5

4:1；用无菌甘露醇‑MES溶液回溶；所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10 ～

7

10cfu/mL；所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成；

所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150；所述恒温培养的温度为

20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次；所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min；用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。

11.根据权利要求4所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成；所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6；所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%；所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次；所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次；所述过滤的温度为0～8℃；所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min；用无菌甘露醇‑MES溶液重悬洗涤2～3次；重悬洗涤时，每次无菌甘露醇‑MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～5

4:1；用无菌甘露醇‑MES溶液回溶；所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10 ～

7

10cfu/mL；所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成；

所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150；所述恒温培养的温度为

20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次；所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min；用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。

12.根据权利要求5所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成；所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6；所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%；所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次；所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次；所述过滤的温度为0～8℃；所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min；用无菌甘露醇‑MES溶液重悬洗涤2～3次；重悬洗涤时，每次无菌甘露醇‑MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～5

4:1；用无菌甘露醇‑MES溶液回溶；所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10 ～

7

10cfu/mL；所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成；

所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150；所述恒温培养的温度为

20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次；所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min；用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。

13.根据权利要求7所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成；所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6；所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%；所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次；所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次；所述过滤的温度为0～8℃；所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min；用无菌甘露醇‑MES溶液重悬洗涤2～3次；重悬洗涤时，每次无菌甘露醇‑MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～5

4:1；用无菌甘露醇‑MES溶液回溶；所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10 ～

7

10cfu/mL；所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成；

所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150；所述恒温培养的温度为

20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次；所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min；用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。

14.根据权利要求2或3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M‑100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M‑100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。

15.根据权利要求4所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M‑100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M‑100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。

16.根据权利要求5所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M‑100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M‑100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。

17.根据权利要求7所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M‑100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M‑100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。

18.根据权利要求10所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd‑SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M‑100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M‑100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M‑100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。