1.一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：构建pBWA(V)H‑cas9‑OsPDCD5载体，

1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(‑):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列；

2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该PCR产物；

3)配制酶切连接体系:

Component Volumes

pBWA(V)H‑cas9i 4μL

PCR 4μL

BsaI/Eco31I 1μL

T4_ligase:1 1μL

Buffer 2μL

H2O 8μL

Total 20μL

37℃持续20min，5次循环；37℃持续10min；20℃持续10min；37℃持续20min；获得连接产物；

4)将5‑10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；

5)挑取菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2‑：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，选取阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；

步骤S2、pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5载体的遗传转化，

1)将pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5载体转化EHA105农杆菌，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5；

2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养

培养基如下表所示：

取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入

0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；

3)农杆菌侵染，

28℃培养EHA105/cas9‑PDCD5农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；

4)转化愈伤的筛选，

共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗3‑5次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素

50mg/L抗性的无菌水清洗2‑3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；

转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2‑4周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；

步骤S3、转化植株筛选与检测，

1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；

2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；

3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得含pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5的阳性转化植株；

步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6‑F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6‑R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定OsPDCD5功能突变的株系；该突变株系的靶标序列为：ACCCAGAGTTGGAATC；

步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长3～8天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量；

所述步骤S1中的靶标序列为：acccagagttggaagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGAGACCagtg；

所述步骤S2中，将含有pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9‑PDCD5；

所述步骤S2中，培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/L琼脂；

所述步骤S3中，扩增检测所使用的扩增引物为Hyg‑CX‑S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg‑CX‑A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT。