1.一种利用CRISPR/Cas9系统靶向修饰水稻落粒性基因qSH1降低水稻落粒性的分子遗传改良方法,其特征包括如下步骤:
1)根据CRISPR/Cas9系统靶点设计要求,在qSH1或LOC_Os01g62920或Os01g0848400编码区和起始密码子5’端附近区域选择合适的靶点;设计的两条靶点序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
2)构建含Target-qSH1-1、Target-qSH1-5双靶点序列的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a载体:首先分别合成带有粘性末端的寡链靶点引物,其中Target-qSH1-1引物的正、反向序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,Target-qSH1-5 引物的正、反向序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,将两对寡链靶点引物变性后冷却至室温完成退火,在将退火后的两个片段分别接连到pYLgRNA-U6a、pYLgRNA-U3载体上,并利用PCR分别扩增含有Target-qSH1-5、Target-qSH1-1靶点的gDNA表达盒;
3)利用所述的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a载体构建含有靶点序列的pCRISPR/Cas9重组载体;
4)将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入受体水稻中,获得转基因阳性植株;
5)利用上述转基因阳性植株获得靶向突变的突变植株;
6)利用上述突变植株加代种植后获得不含转基因成分的纯合突变植株;
7)利用上述纯合突变植株经落粒性调查获得落粒性显著降低的植株作为落粒性改良株;
其中,步骤1)中所述两条靶点序列均含有结构5’-(N)X-NGG-3’结构,N 表示A,T,C 和G 中的任意一个,且 X为19或20并以A或G开头, Target-qSH1-5为反向互补链。
2.如权利要求1所述的方法,其中,步骤2)具体步骤为:先分别合成带有粘性末端的寡链靶点引物,将两条互补配对的寡链靶点引物变性后移至室温冷却完成退火形成双链靶点片段,将退火后的双链靶点片段连接到经酶切后的pU3-gRNA或pU6a-gRNA载体上并利用PCR扩增含有靶点的gDNA表达盒。
3.如权利要求1所述的方法,其中,步骤3)具体步骤为:将PCR扩增后的gDNA表达盒连接到含Cas9 表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
4.如权利要求1所述的方法,其中,步骤4)具体步骤为:将含靶点的pCRISPR/Cas9重组载体转化水稻愈伤组织,经筛选、分化、生根和炼苗后,种植于温室;通过潮霉素基因分子检测鉴定获得阳性转基因水稻植株。
5.如权利要求1所述的方法,其中,步骤5)具体步骤为:选择上述阳性转基因水稻的DNA,用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物扩增上述DNA,扩增产物纯化后测序,测序结果与野生型序列比对,分析转基因植株是否在预期靶点区域发生突变,并分析突变类型、突变靶点基因型,获得T0代突变水稻植株。
6.如权利要求5所述的方法,其中,步骤6)具体步骤为:收获T0代突变植株的种子,继续种植T1代分离群体,通过潮霉素分子检测、靶点扩增测序分析获得靶点基因纯合且不带转基因成分的植株。
7.如权利要求1所述的方法,其中,步骤7)具体步骤为:选择上述植株黄熟期的主穗或大分蘖穗通过仪器法测定籽粒落粒程度,获得落粒性显著降低的植株。